底物亲和设计提高腈水解酶Nit6803活性

腈水解酶(Nitrilase,EC 3.5.5.1),是一类可以将腈类物质一步水解为羧酸的酶,是多种重要大宗化工品、药物中间体的理想生物催化剂。但是天然酶活性低、热稳定性差限制了其在工业上的应用。近年来通过蛋白质改造来解决酶活性与稳定性间的“trade-off”效应以提升催化性能的研究较多。该研究提出一种酶-底物亲和设计改造策略,以来源于Syechocystis sp.PCC6803的腈水解酶Nit6803作为改造对象,结合基于Rosetta的Cartesian_ddG方法和基于自由能微扰的酶-底物亲和力计算,对Nit6803的催化口袋进行单点突变及组合突变设计。基于此获得了活性显著提升的单点突变体F64Y、W170G,及组合突变体F64Y/W170G。其中,F64Y/W170G的比酶活力达到(22.48±0.64)U/mg,为野生型的4.56倍,且该突变体的热稳定性不低于野生型。通过分批补加3-氰基吡啶进行全细胞催化表明F64Y/W170G催化能力强于野生型,在达到相同转化率情况下极大的缩短了催化时间。结果表明,该研究提出的设计策略可以有效提升酶的活性而不影响其稳定性,为酶的理性设计改造提供了新的思路。