掌叶木V-ATP酶C亚基基因克隆及表达模式分析

从珍稀濒危植物掌叶木中克隆了一个V-ATP酶C亚基(HbVATP_C)基因,对其生物信息学特征进行了分析,利用荧光定量技术检测了该基因在不同组织和干旱及盐胁迫下的表达模式。结果显示,该基因开放阅读框全长1128bp,编码375个氨基酸,蛋白分子量是42.57 kD,等电点为5.44,为亲水性蛋白。HbVATP_C具有典型的V-ATP_C结构域,与其他植物同源性较高。HbVATP_C在掌叶木根、茎和叶等不同组织中均有表达,在幼叶中表达水平显著高于其他部位。干旱胁迫下,该基因表达水平均高于对照,盐胁迫下变化不明显,说明该基因能响应干旱胁迫。为进一步研究该基因在掌叶木中的功能奠定了基础。

采用易错PCR对粘质沙雷氏菌几丁质酶C进行定向进化

以重组E.coliBL21(DE3)pLysS/pET22b-Chi C为亲本,采用易错聚合酶链反应(PCR)技术,对粘质沙雷氏菌几丁质酶C基因(Chi C)进行定向进化研究.经过两轮易错PCR后,建立突变体文库,进行平板初筛、包涵体复性及酶活检测复筛,获得一酶活较高的突变酶(Mut-Chi C),其催化活性为亲本重组酶的1.9倍,比活力为出发菌酶活的3.3倍.对突变酶的酶学性质进行初步研究,其最适pH值为5.0,最适温度为60℃,而出发菌该酶的最适温度为40℃.进化酶基因经DNA测序并通过软件与亲本型酶基因进行分析比对,表明突变酶Mut-Chi C基因发生点突变,使4处氨基酸被取代,且均为有义突变.

蛋白激酶C与血管平滑肌α_1肾上腺素受体触发Ca^（2＋）内流的关系

在酶新鲜分离的犬肠系膜上动脉平滑肌细胞，蛋白激酶Ｃ（ＰＫＣ）的激活剂佛波二丁酯（ＰＤＢ）引起的胞内Ｃａ２＋增高作用可被ＰＫＣ抑制剂１－（５－异喹啉磺酰）－２－甲基哌嗪（Ｈ７）所阻断，而哌唑嗪和普萘洛尔则不能阻断ＰＤＢ的这一作用；１０μｍｏｌ·Ｌ－１苯福林引起的胞内Ｃａ２＋增高作用可被１０和２０μｍｏｌ·Ｌ－１Ｈ７部分阻断；在无Ｃａ２＋液，Ｈ７可部分抑制苯福林引起的内Ｃａ２＋释放和外Ｃａ２＋内流，两者分别被抑制了３３±３％和５８±６％；ＫＣｌ（２０－１００ｍｍｏｌ·Ｌ－１）可浓度依赖性地引起胞内钙升高，这一作用可被１０和２０μｍｏｌ·Ｌ－１Ｈ７不同程度地阻断；ＰＤＢ引起的胞内Ｃａ２＋增高也可分别被１．２５和２．５μｍｏｌ·Ｌ－１维拉帕米部分和全部阻断。上述结果提示ＰＫＣ参与苯福林引起的部分内Ｃａ２＋释放和外Ｃａ２＋内流，但以参与外Ｃａ２＋内流为主；这一作用可能与ＰＫＣ激活，引起电压依赖性Ｃａ２＋通道开放有关。

重组产几丁质酶C工程菌包涵体的复性

将重组产几丁质酶C(Chi C)的菌体通过固定金属鳌合层析(IMAC),对目的蛋白进行初步纯化;然后采用透析法、凝胶过滤柱层析法和金属鳌合柱层析法对包涵体进行复性.结果表明,逐渐降低变性剂尿素浓度进行透析复性,酶液的酶活力为58.85μkat.L-1,比活为0.425 mkat.g-1,蛋白回收率为95.3%.使用SepHacry S-200作为复性凝胶介质复性,酶液的酶活力为30.37μkat.L-1,比活为0.620 mkat.g-1,蛋白回收率为72.9%.通过金属螯合层析法复性,酶液的酶活力为55.59μkat.L-1,比活为1.917 mkat.g-1,蛋白回收率为43.2%.

乳酸脱氢酶C与哺乳动物精子能量代谢

哺乳动物精子能量代谢的相关研究对畜牧业与生殖医学领域的发展影响重大,因此,相关的研究一直是热点,其中乳酸脱氢酶C(LDH-C)和精子能量代谢的关系也一直被研究,大部分研究者认为,LDH-C和哺乳动物精子能量代谢相关,但多数实验证据是间接的而且比较分散。综述了对哺乳动物精子能量代谢和LDH-C两个方面的研究,提出LDH-C在精子的能量代谢中扮演着多重角色,不仅直接参与精子的能量代谢,还可能参与哺乳动物精子获能的信号途径,LDH-C和哺乳动物精子的能量代谢密切相关。

溶菌酶C及其生物学功能

在已知6类溶菌酶中,溶菌酶C是唯一存在于脊椎动物、原索动物和无脊椎动物中的类型,也是当前研究最广泛、最透彻的类型。该文从基因数目、基因表达、基因进化和基因功能几个方面详细介绍溶菌酶C的分子生物学研究进展,并认为未来的研究重点已经不是溶菌酶的杀菌作用,而是其消化功能和其他未知的生物学功能。

重组粘质沙雷氏菌几丁质酶C的纯化及酶学性质

为从已构建的重组大肠杆菌pET-22b-chiC获得高纯的几丁质酶C,通过降低培养温度,提高粘质沙雷氏菌几丁质酶C的可溶性表达.表达产物经镍柱亲和层析(IMAC)和Phenyl-Sepharose疏水层析(HIC)分离纯化后,得到电泳纯的几丁质酶.酶学性质研究表明,纯化的几丁质酶C为单体蛋白,相对分子质量为51.8ku;最适pH值为5.0,最适温度为55℃,在55℃的条件下保温4 h后仍有90%以上的酶活力.研究结果还表明,Cu2+,Hg2+,Co2+,Mg2+对酶活力均有明显抑制作用,而Fe2+,Zn2+,Sn2+,Ba2+对酶活力有一定促进作用,Mn2+对酶活力明显促进作用.

蛋白激酶C在糖基化终末产物介导结肠平滑肌细胞内钙离子浓度中的作用

目的:探讨糖基化终末产物(advanced glycation end products,AGEs)对结肠平滑肌细胞内钙离子浓度的影响及可能机制.方法:酶解法分离培养SD大鼠结肠平滑肌细胞(smooth muscle cell,SMC),α-actin免疫荧光鉴定;激光共聚焦显微镜检测(SMC)钙闪烁;蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)活性检测试剂盒检测细胞PKC活性.结果:细胞免疫荧光鉴定大鼠结肠SMC.不同浓度AGEs(50、100μg/mL)刺激结肠SMC后,与对照组比较,钙离子浓度显著降低(56.7%±3.6%、78.6%±5%vs 99.6%±3.1%,P<0.05,P<0.01),50μg/mL为体外最大有效浓度.与对照组相比,AGEs(50、100μg/mL)升高细胞内PKC活性.PKC抑制剂chelerythrine可阻断A G E s介导的钙离子浓度降低(70.7%±3.7%vs 87.1%±2.5%,P<0.05).结论:AGEs可激活PKC通路、从而降低胞内钙离子的浓度,最终抑制大鼠结肠平滑肌收缩.

幽门螺杆菌尿素酶C基因的克隆表达及其免疫原性的鉴定

目的 利用 PCR方法扩增 Hp ure C基因 ,将其克隆入表达载体 p BV2 2 0中以表达 Hp ure C重组蛋白 ,并验证其抗原性和免疫原性 .方法 用 PCR方法从 Hp临床株中扩增Hp ure C基因 ,经 Eco R 和 Bam H 双酶切后克隆入 p GEM-3Zf(- )中 ,用全自动测序仪进行双向测序 .然后将目的片段克隆入表达载体 p BV2 2 0中 ,温度诱导表达 Hp ure C重组蛋白 .用 Western Blot实验验证表达蛋白的抗原性 ,用免疫动物实验验证其免疫原性 .结果 用 PCR方法从 Hp临床株中扩增得到了一段 1173bp的 Hp ure C基因片段 ,对其进行测序 ,经BL AST分析证明所得 DNA序列与 Hp标准菌株 M6 0 398的同源性为 95 % .通过温度诱导 ,获得了 Mr为 4 4× 10 3的 Hpure C重组蛋白质 .经 Western Blot实验和免疫动物实验证实表达的蛋白质有较强的抗原性和免疫原性 .结论 成功地在E.coli中表达了 Hp ure C重组蛋白并证明其有较强的抗原性和免疫原性 .

缺血再灌注蛋白激酶C同工酶表达与神经元凋亡关系的研究

目的 研究局灶脑缺血 /再灌注大鼠蛋白激酶 C( PKC)同工酶表达在缺血性脑损害中可能的作用机制。方法 采用线栓法制备大鼠局灶脑缺血 /再灌注模型。于缺血 1 .5h再灌注 4 h、2 4 h、72 h观察 PKCγ、δ表达及神经元坏死、凋亡的变化规律。结果 再灌注 4 h PKCγ、δ及神经元凋亡明显升高 ,PKCγ在 2 4 h达高峰 ,72 h开始下降 ( P <0 .0 5) ;PKCδ在再灌注 2 4 h、72 h仍保持一高水平 ( P >0 .0 5) ,神经元凋亡的变化规律同 PKCγ( P <0 .0 5) ;神经元坏死在再灌注各时相点无显著性差异 ( P >0 .0 5)。结论 PKCγ、δ的异常表达与神经元坏死、凋亡有密切的联系。

胰岛素、卡托普利对糖尿病大鼠肾小球蛋白激酶C同工酶表达变化的影响

目的探讨胰岛素、卡托普利对糖尿病(DM)大鼠不同阶段肾小球蛋白激酶C(PKC)同工酶表达变化的影响及其对糖尿病肾病的保护作用。方法将实验动物随机分为STZ-DM模型组、胰岛素治疗组及卡托普利治疗组2、4和12周,采用免疫组化方法检测PKC同工酶在肾小球细胞的表达变化情况。结果胰岛素治疗使DM大鼠的高血糖和多尿得到明显控制,并使已经升高的内生肌酐清除率(Ccr)显著下降,减轻了肾重/体重的增加。卡托普利治疗12周显著降低了DM大鼠尿蛋白排泄率和肾重/体重。在肾小球细胞内,PKCα在DM发病2、4和12周时表达显著上升(P<0.05);PKCβⅡ在DM发病2周时表达明显下降(P<0.05),4和12周时恢复正常。胰岛素、卡托普利明显抑制了2和4周组DM大鼠肾小球PKCα的表达以及4周组DM大鼠PKCβ2的表达(P<0.05);卡托普利使12周组DM大鼠肾小球PKCα、PKCβ2表达明显下降(P<0.05)。结论胰岛素、卡托普利通过调节DM大鼠肾小球细胞PKCα和PKCβ2表达延缓糖尿病肾病(DN)的发生、发展。

缺血再灌注大鼠脑保护过程中蛋白激酶C同工酶抑制剂的作用(英文)

背景:蛋白激酶C(ProteinKinaseC,PKC)抑制剂能明显减轻缺血性脑损害,但其毒副作用大、价格昂贵。灯盏花素注射液能明显抑制PKC活性,对缺血性脑损害有一定的保护作用。目的:研究局灶脑缺血再灌注大鼠PKC抑制剂灯盏花素缺血脑保护作用的可能机制。设计:完全随机设计,对照实验研究。主要观察指标:采用线栓法制备大鼠局灶脑缺血再灌注模型。于缺血1.5h再灌注4,24,72h观察PKC同工酶γ蛋白表达及神经元凋亡的变化规律。结果:再灌注4hPKCγ及神经元凋亡明显升高,PKCγ在24h达高峰,72h开始下降(P<0.05);神经元凋亡的变化规律同PKCγ(P<0.01);灯盏花素组再灌注24h前能明显抑制PKCγ及神经元凋亡的表达(P>0.05)。结论:灯盏花素的缺血脑保护作用可能与其下调PKCγ蛋白表达有关。

川西高原黑唇鼠兔乳酸脱氢酶C基因的原核表达

[目的]研究黑唇鼠兔乳酸脱氢酶C(LDH-C)基因的原核表达及重组蛋白的纯化。[方法]采用RT-PCR方法克隆鼠兔LDH-C基因,并将其连接到表达载体pET-32a上,构建鼠兔LDH-C基因的大肠杆菌BL21(DE3)工程菌,通过IPTG诱导表达,表达产物用SDS-PAGE进行分析,使用亲和层析方法进行蛋白纯化。[结果]RT-PCR扩增出1条约1.0 kbp的条带,与预期结果相符;重组表达载体经PCR和双酶切鉴定,产生1个约1.0 kbp的目的片段,表明表达载体构建成功;表达产物经SDS-PAGE分析,得到了分子量略大于45.0kDa以包涵体形式存在的融合蛋白;通过镍亲和层析柱进行纯化,得到了较纯的融合蛋白。[结论]黑唇鼠兔LDH-C基因被成功克隆和表达。

实验性大鼠脑出血后细胞凋亡与蛋白激酶C同工酶表达的关系及水蛭素的干预作用

目的探讨大鼠脑出血后蛋白激酶C同工酶表达及细胞凋亡程度,以及水蛭素对二者的影响。方法采用未抗凝新鲜自体股动脉血注入大鼠尾状核建立脑出血动物模型,75只大鼠随机分为对照组、脑出血组及水蛭素组。用免疫组织化学法及原位末端标记法分别测定脑出血后6 h、1天、3天、6天、10天等时间点血肿周围组织蛋白激酶C同工酶的表达和细胞凋亡程度,以及水蛭素对二者的影响。结果与对照组比较,血肿周围组织中蛋白激酶C同工酶水平及凋亡细胞数在脑出血后6 h升高(P<0.05),第3天达高峰(P<0.001),此后下降,10天时的表达接近正常,差异无显著性(P>0.05);水蛭素能够降低各个时间点蛋白激酶C同工酶水平及凋亡细胞的表达。结论脑出血后血肿周围蛋白激酶C同工酶水平及凋亡细胞的表达均上调,而水蛭素能够抑制细胞凋亡,其机制可能与抑制蛋白激酶C同工酶的表达有关。

外酶C3转移酶转基因表达对小梁细胞的影响

目的:探讨腺病毒载体介导的外酶C3转移酶(exoenzyme C3 transferase,C3)表达对体外培养的正常或地塞米松处理的人类小梁细胞的作用.方法:构建C3和绿色荧光蛋白(GFP)的腺病毒表达载体(AdC3GFP).用AdC3GFP转导人类正常或经地塞米松处理的小梁细胞.观察(1)小梁细胞肌动蛋白、粘着斑蛋白(vinculin)、β-链蛋白(β-catenin)的变化;(2)地塞米松能否诱导小梁细胞形成肌动蛋白交联网(cross linked actin networks,CLANs)结构以及AdC3GFP对CLANs的影响.以仅表达GFP的腺病毒载体(AdGFP)作为对照.结果:与对照相比,AdC3GFP转导小梁细胞后3～4d细胞出现肌动蛋白细胞骨架裂解,相应粘着斑蛋白阳性的粘着斑减少和β-链蛋白染色丧失.与非转导细胞相比,AdGFP转导细胞肌动蛋白细胞骨架,粘着斑蛋白和β-链蛋白染色均与非转导细胞类似.经地塞米松处理的小梁细胞形成典型CLANs结构,AdC3GFP可降解肌动蛋白及已形成的CLANs结构.结论:C3基因表达产物可降解小梁细胞肌动蛋白和细胞连接以及由地塞米松诱导的小梁细胞CLANs形成.提示C3基因治疗可能是青光眼降眼压治疗的有效方法.

精液乳酸脱氢酶C4同功酶的底物选择性测定法

目的 建立一种简便、准确测定精浆、精子中的 L DH- C4同功酶的检测方法。方法 采用特异底物的酶动力学分光光度法测定人精子、精浆中 L DH- C4同功酶活性。其结果与常规的丙稀酰胺凝胶电泳分离 ,活性染色 ,光密度扫描法进行比较。结果 两种方法间存在较好的相关 ( r=0 .93 2 ,n=12 8)。以 5 .0 mmol/ L的α-酮己酸底物浓度可以选择性的检测出精液样品的 L DH- C4活性。结论 本方法具有微量、快速的优点 ,适于在临床检验中推广应用。

重组基因工程菌几丁质酶C的可溶性表达研究

在不同培养温度条件下对产几丁质酶C的基因工程菌BL21(DE3)进行诱导,使其表达可溶性蛋白。随后在较佳培养温度诱导条件的基础上向培养基中添加不同浓度的甘油,甘氨酸,山梨醇/甜菜碱等成分来更进一步的提高几丁质酶C的可溶性表达。其结果是在25℃诱导条件下,以添加2 g/L葡萄糖的LB培养基作为基础培养基进行培养,在基础培养基中添加3 g/L甘油的总酶活最高,达到了18.17 U/mL,较之仅含2 g/L葡萄糖的LB培养基在37℃及25℃诱导培养条件下酶活力分别提高了41.6%和20.3%;添加0.3%甘氨酸约90%的可溶性几丁质酶表达到了胞外,胞外酶活达到14.68 U/mL;添加0.5 M山梨醇/2.5 mM甜菜碱工程菌胞内酶活达到最高,为8.43 U/mL。结果表明适当降低工程菌诱导表达时的培养温度提高了几丁质酶C的可溶性表达,在较佳温诱导表达的基础上向培养基中添加不同浓度的甘油,甘氨酸,山梨醇/甜菜碱更进一步的提高了几丁质酶C的可溶性表达。

乳酸脱氢酶C4的精子免疫荧光定位特性

用１４个抗小鼠ＬＤＨ－Ｃ４的单克隆抗体对小鼠、树鼯和人精子的ＬＤＨ－Ｃ４进行了间接免疫荧光定 位。结果显示：不同的单抗可以结合到小鼠精子表面不同的位置，其中ＰＡ１（Ｋ０２１）在尾部，ＰＡ２ （Ｋ０２２）、ＰＡ４和ＰＡ５（Ｋ０２３）在中段和尾部， ＳＭ１、 ＳＭ２和ＰＧ２在中段， ＳＭ３和ＳＭ４在顶体， ＳＭ５ 在顶体和赤道板。人和树鼯精子表面的ＬＤＨ－Ｃ４也呈现类似的情况。这些研究表明精子表面的 ＬＤＨ－Ｃ４呈现多位点分区分布，精子的不同部位暴露的ＬＤＨ－Ｃ４的抗原决定簇不同。在被检动物中， ＬＤＨ－Ｃ４显示明显的同源性。