乙酰羟基酸合酶在支链氨基酸生产中的研究进展

乙酰羟基酸合酶(acetohydroxyacid synthase,AHAS)是一种硫胺素二磷酸(thiamine diphosphate,ThDP)依赖性酶,是催化支链氨基酸(branched chain amino acid,BCAA),即L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸生产的第一步关键酶。AHAS容易受到末端产物BCAA的反馈抑制,从而抑制该酶的活性并影响流向支链氨基酸的碳通量。因此,AHAS成为高产支链氨基酸的重要靶点,对AHAS的改造具有重要意义。本文介绍AHAS的结构、催化机理以及该酶在BCAA合成途径中的作用,总结对该酶催化过程的研究现状以及目前对AHAS的分子改造策略,最后提出该酶未来的研究方向以及改造策略。

酿酒酵母中脱氧羟腐胺赖氨酸合酶的结构研究

目的通过研究酿酒酵母中脱氧羟腐胺赖氨酸合酶DHS(Dys1)的结构,揭示羟腐胺赖氨酸化修饰的分子机制,为人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)等高增殖性疾病的治疗提供理论基础和依据。方法利用大肠埃希菌BL21表达系统,体外构建表达载体并表达Dys1。通过亲和层析、分子筛等方法分离纯化Dys1的蛋白质样品。在6%聚乙二醇(PEG)8000、0.1 mol/L羟乙基哌嗪乙磺酸(Hepes)pH 6.5、8%乙二醇的条件下得到Dys1的锥形晶体。用X射线衍射晶体,用CCP4i、Coot软件解析2.8分辨率下的Dys1三维晶体结构。结果Dys1的整体结构为四聚体,活性口袋和辅因子NAD+结合位点位于每个单体之间,单体的核心部位形成一个罗斯曼折叠,构成活性位点的氨基酸残基具有高度保守性。结论首次解析了Dys1的三维结构,发现了辅因子NAD+与酶的结合模式,证实了该酶四聚体的形式和N端的模体是其行使催化功能所必需的。

蛋氨酸合酶、蛋氨酸合酶还原酶基因多态性与类风湿关节炎患者甲氨蝶呤疗效相关性的研究

目的探讨类风湿关节炎（RA）患者蛋氨酸合酶（MTR）A2756G、蛋氨酸合酶还原酶（MTRR）A66G基因多态性与甲氨蝶呤（MTX）治疗的疗效和不良反应相关性。方法采用实时荧光定量PCR方法检测107例单用MTX的RA患者的MTR A2756G及MTRR A66G基因多态性,并与其治疗疗效和不良反应结合分析。结果MTR A2756G及MTRR A66G的单基因多态性与RA患者服用MTX的疗效及不良反应无相关性（P〉0.05）。两基因联合作用分析显示,同时是MTR AG型和MTRR AG/GG型者较同时是MTRAA型和MTRR AA型的RA患者对MTX治疗效果差（OR=0.19,95%可信区间为0.04~0.88）,差异有统计学意义（P=0.03）,没有发现两者联合作用与其不良反应有相关性（P〉0.05）。结论MTR和MTRR基因多态性可能对于RA患者服用MTX的疗效存在预示作用。

两株抗乙酰羟酸合酶类除草剂克雷伯氏菌的分离及其AHAS基因ilvIH的克隆

乙酰羟酸合酶(AHAS)是磺酰脲类、咪唑啉酮类、三唑嘧啶类、磺酰胺类和嘧啶水杨酸类等乙酰羟酸合酶抑制剂类除草剂的作用靶标,获得能抗此类除草剂的AHAS突变基因资源具有非常重要的理论和应用价值.本文从长期使用磺酰脲类除草剂的农田土壤中分离到2株抗性细菌HR9和HR11,根据其表型特征、生理生化特性和16SrDNA序列系统发育分析,初步鉴定为克雷伯氏菌(Klebsiella sp.).菌株HR9和HR11对甲磺隆的最高耐受浓度分别达到9600μmol/L和8200μmol/L,且对各种乙酰羟酸合酶抑制剂类除草剂具有交叉抗性.利用PCR技术从HR9、HR11和实验室保存的一株除草剂敏感型克雷伯氏菌LB-2的总DNA中克隆到编码AHAS的基因ilvIH,其中ilvI编码大亚基即催化亚基,ilvH编码小亚基即调节亚基.比对结果表明,菌株HR11与菌株HR9的ilvI有6个位点的氨基酸存在差异,HR9、HR11与LB-2的ilvI各有20和16个位点的氨基酸存在差异.

甘蓝型油菜异分支酸合酶基因的克隆及信号通路相关基因的诱导表达

为了解异分支酸合酶1(ICS1,水杨酸合成的限速酶)在甘蓝型油菜抗病过程中的功能,以甘蓝型油菜耐菌核病品种宁RS-1为材料,在核盘菌侵染时,研究甘蓝型油菜ICS1基因和水杨酸信号通路相关基因的诱导表达。首先利用同源序列法克隆得到宁RS-1中ICS1基因的c DNA序列,命名为Bn ICS1。Bn ICS1序列全长1 719bp,编码572个氨基酸残基,含有1个分支酸结合域。表明油菜中也存在异分支酸途径。接种核盘菌前、后及不同时期荧光实时定量PCR结果发现Bn ICS1在核盘菌接种后6hpi(接种后6h)表达量升高,但是24hpi后降低;而MPK4基因的表达量在6hpi降低,24hpi后升高,说明SA合成先是被核盘菌诱导,但随后又被抑制。EDS5基因和PR1基因表达量从接种后6hpi持续升高,而PDF1.2基因的表达量不断降低,说明SA信号通路最终受核盘菌诱导形成病斑,而茉莉酸途径及其诱导的植物防御反应受到抑制。

蛋氨酸合酶基因变异与先天性心脏病的关系

目的 蛋氨酸合酶 (MS)是同型半胱氨酸代谢关键酶 ,旨在了解其与先天性心脏病(CHD)发生的关系。方法 选择 186名多种类型CHD患者 (0～ 31岁 ,性别比约为 1∶1)作为病例组 ,以同地区且年龄、性别匹配的 10 3名正常人作为对照 ,进行MS基因A2 75 6G位点多态性分析 (PCR RFLP法 )及血清叶酸、维生素B12 (VB12 )水平的测定 (放射免疫法 )。结果 显示本研究人群中存在MS基因A2 75 6G位点杂合突变 (+ - ) ,但未检出纯合突变 (+ +)基因型 ;其中对照组 (+ - )基因型和 (+)等位基因的频率分别为 10 7%和 5 3% ,低于报道的白种人及日本人变异频率 ;病例组 (+ - )基因型和 (+)等位基因的频率为 9 1%和 4 6 % ,与对照组相比其基因型构成差异无显著性 ;(+ - )基因型罹患CHD的比值比 (OR)为 0 84 (95 %可信区间 ,0 35～ 2 0 1) ;不同类型CHD与对照组的基因型构成亦无明显差异 ;此外病例组血清VB12 水平低于对照组 (336 6 6pmol L和 4 6 5 72pmol L) ,但无统计学意义 (P >0 0 5 ) ;两组的叶酸水平无明显差异 ;病例组不同基因型叶酸、VB12 水平差异亦无显著性。结论 MS基因A2 75 6G位点变异与CHD及血清叶酸、VB12 水平无明显关联 ,还有待进一步研究。

亲代蛋氨酸合酶基因变异对子代发生先天性心脏病的影响

目的 :初步探讨亲代蛋氨酸合酶 (MS)基因变异与子代先天性心脏病 (CHD)表型的关系。方法 :通过出生缺陷登记卡选择辽宁省 192名CHD患者 (其中男 93人 ,女 99人 )及其生物学父母 (核心家庭 )作为病例组 ,另选取同地区无出生缺陷病史及家族史的 10 4名正常人 (男 6 0人 ,女 4 4人 )及其生物学父母作为对照组 ,进行MS基因A2 75 6G位点多态性检测 (PCR RFLP法 ) ,比较两组间亲代基因变异差异及病例组核心家庭内等位基因的传递不平衡现象。结果 :病例组与对照组母亲的基因型分布和等位基因频率差异无显著性 (P >0 .0 5 ) ,病例组父亲 (+)等位基因频率 (5 .0 % )低于对照组 (9.1% ,P =0 .0 6 0 ) ,其子代罹患CHD的比值比 (OR)为 0 .5 3(95 %CI为 0 .2 5～ 1.0 9) ;两组父母基因型组合差异无显著性 ;不同类型CHD组与对照组父母A2 75 6G位点基因型构成比差异亦无显著性 ;等位基因传递不平衡分析显示 ,突变等位基因 (+)在CHD核心家庭中存在传递不平衡现象 ,即父母将等位基因 (+)传给CHD患者的比例低于 (- ) ,其OR值为 0 .2 6 (95 %CI为 0 .11～ 0 .6 0 )。结论 :亲代MS基因A2 75 6G位点变异与子代CHD的发生相关 ,其突变等位基因 (+)可能降低子代CHD的危险性。

转化生长因子β_1对香烟诱导的大鼠肺泡巨噬细胞γ-谷氨酰半胱氨酸合酶表达的影响

目的:探讨转化生长因子(TGF)-β1对香烟诱导的大鼠肺泡巨噬细胞γ-谷氨酰半胱氨酸合酶(γ-GCS)和活化蛋白(AP)-1亚单位c-fosmRNA及其蛋白表达的影响。方法:通过支气管肺泡灌洗获取大鼠肺泡巨噬细胞,随机分为对照组、香烟组和TGF-β1组。TGF-β1组加入终浓度为3μg/L的TGF-β1,2 h后除对照组外,余2组均加入香烟烟雾提取物,对照组加入磷酸盐缓冲液。分别用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和免疫细胞化学方法检测肺泡巨噬细胞中γ-GCSh(重链亚单位)及c-fosmRNA和蛋白的表达。结果:香烟组γ-GCSh和c-fosmRNA及其蛋白表达水平显著高于对照组(分别P<0.05,P<0.01)。TGF-β1组γ-GCSh mRNA及其蛋白表达水平明显低于香烟组(均P<0.01);而c-fosmRNA及其蛋白表达水平明显高于香烟组(均P<0.01)。结论:转化生长因子-β参与香烟所致慢性阻塞性肺疾病肺氧化/抗氧化失衡的发病机制。

油菜乙酰羟基酸合酶基因BnAHAS1的克隆及其重组蛋白质的原核表达

利用RT-PCR技术从甘蓝型油菜宁油16号(Brassica napus L.)中克隆到乙酰羟基酸合酶基因BnAHAS1的cDNA序列,该序列含有1个1 968 bp的开放阅读框,编码蛋白质655个氨基酸,分子量约为7.1×104,预测等电点为6.16。将该基因克隆到原核表达载体pCold II中,经酶切和测序鉴定后,将正确的重组质粒pCold IIBnAHAS1导入大肠杆菌BL21(DE3)。在15℃下以终浓度为1 mmol/L的IPTG诱导12 h后,获得预期大小的重组蛋白质His-BnAHAS1,并用Western blot确定此重组蛋白质为目的蛋白质。

中医药对各型慢性阻塞性肺疾病大鼠核因子κB和γ-谷氨酰半胱氨酸合酶表达的影响

目的通过观察慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠核因子κB和γ-谷氨酰半胱氨酸合酶(γ-GCS)水平的变化,探讨中医药治疗COPD的机理。方法采用改良烟熏加气管滴加脂多糖方法复制COPD模型,以免疫组化法检测核因子κB和γ-GCS水平。二次造模后,各治疗组分别灌服相应证型的中药合剂,连续14天。寒痰蕴肺治疗组灌服小青龙汤煎剂,痰热阻肺治疗组大鼠灌服麻杏石甘汤煎剂,肺气虚治疗组灌服玉屏风散煎剂,脾气虚治疗组灌服六君子汤煎剂,肾气虚治疗组灌服人参蛤蚧散煎剂,模型组大鼠每天给与2mL生理盐水灌胃。空白对照组不做任何干预。结果与空白对照组相比,各模型组γ-GCS、NF-κB在支气管和肺泡上皮等都为高表达;经过中药治疗后,阳性表达率有明显降低,其差异均有显著性(P<0·05)。结论通过辨证论治各中药方剂能纠正COPD大鼠的氧化/抗氧化失衡,减少炎性反应,从而有效治疗COPD。

胸苷酸合酶在胃癌的表达及临床病理学意义

目的 观察胃癌中胸苷酸合酶 (TS)的表达情况及其与患者年龄、性别、分化程度、淋巴结转移及预后的关系 ,探讨 TS的临床病理学意义。 方法 采用免疫组织化学 SP法及计算机图像分析法测定 70例胃癌组织 (每例患者术后均经以 5 -氟尿嘧啶 (5 - FU)为主的化疗 )及 30例正常组织中 TS的表达。 结果 正常胃粘膜 TS水平高于胃癌组织 ,高分化胃癌组的 TS水平高于中低分化组 ,胃癌组织中 TS表达水平与患者的年龄、性别及有否淋巴结转移无关 ;TS低表达组患者的预后优于 TS高表达组。 结论 胃癌组织中 TS表达水平可作为患者对 5 -

决明异分支酸合酶基因的克隆及表达分析

异分支酸合酶(Isochorismate synthase,ICS)控制着分支酸到异分支酸衍生的各种产物的分配,据报道它是植物体内蒽醌类物质合成的限速酶.该文采用cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆其基因全长(SoICS);以荧光定量PCR(FQ-PCR)测定其在植株各部位的表达谱并考察其与蒽醌质量分数的关系.结果表明,SoICScDNA全长为2 103bp(GenBank Accession KF547925);有多个非典型的加尾信号;含一个总长为1 713bp的完整阅读框,编码570个氨基酸;SoICS含有AtICS1和AtICS2中与ICS催化活性相关的5个保守关键氨基酸残基;其N-端有48个氨基酸残基的推定前导序列;具有典型的保守分支酸结合结构域;有多个显著磷酸化位点;其蛋白质三维结构是一个紧凑型球状结构;系统分析显示,决明ICS与蓖麻、毛果杨和山杨的ICS关系较近.FQ-PCR分析表明,ICS基因在叶中表达水平最高,其次为茎、荚果皮、幼果和种子,在根和花中的表达量最低;总蒽醌、游离蒽醌和结合蒽醌质量分数的相关性达到极显著水平,但SoICS转录本表达量和蒽醌质量分数之间没有达到显著相关水平.

海南黎族肺腺癌患者胸苷酸合酶mRNA表达水平对培美曲塞化疗预后的影响

目的探讨海南黎族肺腺癌患者癌组织中胸苷酸合酶(TS)mRNA表达水平对培美曲塞辅助化疗预后的影响。方法选取2008年6月—2009年4月在我院手术治疗的晚期肺腺癌患者52例,采用培美曲塞为主的方案进行辅助化疗。采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)和相对定量的方法分别检测患者癌组织及癌旁组织中TS mRNA的表达水平,分析TS mRNA表达水平对患者化疗预后的影响。结果 52例肺腺癌患者中,35例(67.3%)癌组织TS mRNA表达水平低于其癌旁组织。52例肺腺癌患者癌组织中TS基因mRNA表达水平相差67倍,以临界值(cut-off均值)为界,TS mRNA高表达患者29例(55.8%),低表达患者23例(44.2%)。癌组织中TS mRNA低表达组患者的无复发生存率(61.0%)和总生存率(56.5%)均高于高表达组(39.0%和43.5%)(P<0.05)。结果癌组织中TS mRNA低表达的患者更能从培美曲塞为主的辅助化疗方案中受益;检测癌组织中TS mRNA表达水平有助于预测患者对化疗药物的敏感性。

拟南芥氰丙氨酸合酶CYS-C1基因扩增及多克隆抗体制备

已有研究结果表明,植物自身能产生剧毒的氰化物(如HCN),而氰丙氨酸合酶(Cyanoalanine synthase,CAS)是植物解氰作用的关键酶,在植物生长、发育及逆境胁迫响应过程中起重要作用。本研究通过克隆拟南芥CAS合酶关键基因CYS-C1全长后,构建原核表达载体p EASY-CYS-C1并导入大肠杆菌E.coli受体细胞中进行表达。结果表明,在大肠杆菌E.coli细胞中成功诱导出可溶性的CYS-C1蛋白,其中IPTG最佳诱导时间为4 h,最佳诱导浓度为0.2 mmol/L。原核表达的CYS-C1蛋白经Ni柱纯化并免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,Western blot检测结果表明,CYS-C1蛋白多克隆抗体的特异性较好。本试验结果对于进一步开展CAS合酶的功能研究奠定了基础。

中医药对各型慢性阻塞性肺疾病大鼠γ-谷氨酰半胱氨酸合酶表达和气道病理改变的影响

[目的]通过观察慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠γ-谷氨酰半胱氨酸合酶(γ-GCS)水平和气道病理改变的变化,探讨中医药治疗COPD的机制。[方法]采用改良烟熏加气管滴加脂多糖方法复制COPD模型,光镜下观察大鼠小气道病理改变,电镜下观察大鼠气管纤毛的变化,并以免疫组化法检测γ-GCS水平。[结果]各方剂能缓解肺内细支气管、终末细支气管管腔及周围炎细胞浸润及分泌物阻塞;恢复纤毛粘连、倒伏、脱落,从而改善气道高反应性和气道重塑;与正常对照组相比,各造模组γ-GCS在支气管和肺泡上皮细胞、平滑肌细胞以及炎细胞等都为高表达(P<0.01),经过治疗后,阳性表达率有明显降低,其差异具显著性(P<0.05)。[结论]通过辨证论治各中药方剂能纠正COPD大鼠的氧化抗氧化失衡,减少炎性反应,对于COPD气道的修复和炎症具有缓解作用,从而有效治疗各型COPD。

水稻种子萌发过程中氰丙氨酸合酶的活性变化与分布

水稻 (秀水 11)种子在吸涨 3d后氰丙氨酸合酶(CAS)活性才开始出现 ,其根、叶和胚乳中的CAS活性在萌发过程中均呈不断上升趋势 ,根中的CAS活性始终明显高于叶和胚乳 ,而萌发前期叶片CAS活性明显高于胚乳 ,但后期二者几乎相当。电泳结果显示其叶片、根和胚乳中均含有两种CAS同工酶 ,根和胚乳中CAS1(迁移率较小者 )的活性明显高于CAS2 (迁移率较大者 ) ,而叶片中二者的活性相差不大。叶片细胞质中上述两种CAS同工酶都有 ,而线粒体中只有CAS1,叶绿体中两种CAS都没有。

中国淋巴囊肿病毒胸苷酸合酶基因结构特点及分析

胸苷酸合酶(Thymidylate synthase, TS)是进行 DNA 合成所必需的酶类,与细胞分化及肿瘤发生密切相关。淋巴囊肿病毒属于虹彩病毒科成员,是能引起百余种淡、海水鱼感染,并产生肿瘤的病毒病原。在已完成中国淋巴囊肿病毒株 (Lymphocystis disease virus-China, LCDV-C) 基因组序列测定的基础上,本文对位于 LCDV-C 基因组开放阅读框 ORF 011L 的 TS 基因结构、及其推定蛋白结构进行了分析。该基因全长 858bp,GC 含量为 28.2%,编码一个长为 286aa、分子量为 32.7kD、等电点为 7.1 的推定蛋白,称之为中国淋巴囊肿病毒胸苷酸合酶(LCDV-CTS)。该酶所具有的叶酸结合区在第 44 和 70 位氨基酸之间,dUMP 结合区在第 163 和 206 位氨基酸之间,24个必需氨基酸具有高度保守性。二级结构预测结果显示 LCDV-C TS 含 8 个 α 螺旋,6 个 β 折叠和 23 个环,表明其具备酶活性分子所有的柔性和可变性结构特征。这是迄今所知在脊椎动物虹彩病毒中唯一含两个完整结合区的 TS。对来自包括 LCDV 在内二十个物种的 TS 结构进行同源性分析,显示 LCDV-C TS 被单独分为一枝。进一步对 LCDV-C TS 可能的起源途径及与宿主的作用等进行了探讨。

玉屏风散对慢性阻塞性肺疾病大鼠核因子κB和γ-谷氨酰半胱氨酸合酶表达的干预作用

目的:通过观察慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠核因子κB(NF-κB)和γ-谷氨酰半胱氨酸合酶(γ-GCS)水平的变化,探讨玉屏风散治疗COPD的机理。方法:采用改良烟熏加气管滴加脂多糖方法复制COPD模型,并以免疫组化法检测NF-κB和γ-GCS水平。结果:与正常对照组相比,造模组γ-GCS、NF-κB在支气管和肺泡上皮细胞、平滑肌细胞以及炎性细胞等都为高表达(P<0.01),经过治疗后,阳性表达率有明显降低,其差异具显著性(P<0.05)。结论:玉屏风散有着纠正氧化、抗氧化失衡,减少炎性反应的作用,对于肺气虚型COPD疗效确切。

转录因子Klf2和Nrf2/Bach1调控γ-谷氨酰半胱氨酸合酶在气道上皮细胞中的作用

目的通过研究锌指Krüppel样转录因子2(Klf2)及红系衍生核因子相关因子2(Nrf2)/BTB-CNC异体同源体1(Bach1)在经香烟烟雾提取物(CSE)刺激的大鼠气道上皮细胞中的表达,了解其感受氧化应激对靶基因γ-谷氨酰半胱氨酸合酶(γ-GCS)的调控作用。方法采用酶消化法提取大鼠原代气管-支气管上皮细胞,并用10%CSE干预细胞6 h,收集细胞,双酶法检测γ-GCS活性;通过免疫细胞化学法观察Nrf2/Bach1的核转位;采用Western blot和RT-PCR技术研究细胞中Klf2、Nrf2、Bach1、γ-GCS的蛋白及mRNA表达。结果大鼠气管-支气管上皮细胞经CSE诱导后其γ-GCS活性明显增高。免疫细胞化学结果显示Nrf2经CSE刺激后出现由核外向核内的转位,Bach1经CSE刺激后出现由核内向核外的转位。Western blot结果显示CSE处理组中Klf2、Nrf2、Bach1、γ-GCS蛋白水平较对照组显著升高(P<0.05);RT-PCR结果显示CSE处理组中Klf2、Nrf2、Bach1、γ-GCS mRNA水平较对照组显著升高(P<0.05)。直线相关分析表明γ-GCS蛋白表达与Klf2、Nrf2、Bach1呈正相关(P<0.05)。结论 CSE可能通过转录因子Klf2、Nrf2、Bach1调节γ-GCS的表达。