黑曲霉酸性α-淀粉酶基因和糖化酶基因对工业酒精酵母的整合及其共表达

用PCR合成的黑曲霉 (Aspergillusniger)酸性α 淀粉酶 (Acidα amylase)的cDNA ,构建了由酵母醇脱氢酶(ADH1 )启动子和终止子引导表达 ,酸性α 淀粉酶自身信号肽序列引导分泌的表达元件 ,与黑曲霉糖化酶cDNA的表达元件同时插入由酵母rDNA序列引导同源整合的酵母YIp型表达载体pWHY中 ,构成双基因表达分泌质粒pWAG。采用pWAG与酵母YEp型G4 1 8抗性表达质粒的共转化 ,将两个基因表达元件整合到酒精生产酵母菌株AS2 346的染色体rDNA序列中 ,获得同时表达胞外酸性α

酸性α-淀粉酶菌株的诱变及酶的性质研究

以醋醅中筛选出产α-淀粉酶的酵母菌为出发菌进行N+离子注入诱变,使产物酶活提高了219%,达到497U/g。对其所产-α淀粉酶进行分离纯化,实验表明,该酶的最适温度为60℃,最适pH值为4.0,分子量约为81kDa,Ca2+对该酶的激活作用不明显。薄层层析结果表明,该酶水解淀粉产物为糊精和多种低聚糖。

产耐酸性α-淀粉酶菌株的筛选及其固态发酵条件的优化

以酒糟为原料,应用锥虫蓝法,通过比较透明圈直径与菌落直径的比值,能较快选出目的菌株,经筛选得到1株产耐酸性-α淀粉酶的野生AS-Y菌株,其酶活达到64.3U/g。通过鉴定为曲霉AS-Y菌株,并对AS-Y菌株的固态发酵条件进行了优化。

1株产酸性α-淀粉酶黑曲霉原生质体制备和再生条件优化

通过单因素试验、Plackett-Burman(PB)试验和响应面优化获得产酸性α-淀粉酶黑曲霉孢子原生质体制备和再生的最佳工艺参数:黑曲霉种龄72 h、孢子浓度7.5×106CFU/mL、渗透压稳定剂甘露醇浓度0.85 mol/L,以10 g/L蜗牛酶+10 g/L纤维素酶+10 g/L溶菌酶为破壁酶、pH 6.8、酶解温度37℃、酶解2 h。在此条件下,原生质体制备率可达86.92%,再生率可达42.67%。

来源于酸热脂环酸杆菌的嗜酸性α-淀粉酶的表达研究

从嗜酸耐热的酸热脂环酸杆菌Alicyclobacillusacidocaldarius中克隆到α_淀粉酶的基因 (amy) ,该基因全长 390 3bp ,编码130 1个氨基酸 ,理论分子量约 14 0kD。将基因amy分别克隆到大肠杆菌E .coli表达载体pET_2 2b(+)和毕赤酵母P .pastoris表达载体pPIC9α ,并在大肠杆菌和毕赤酵母中得到了表达 ,表达产物具有淀粉酶的活性。对酵母中表达的酶蛋白AMY进行了纯化 ,并初步研究了它的酶学性质 ,它的作用最适pH 3 2 ,在pH 2 5～ 4 6范围内 ,酶活性保留 5 0 %以上 ,它的最适温度 6 5℃ ,在 70℃下处理 30min ,酶活性维持 5 0 %以上 ,基本保留了天然酶蛋白的耐热性和嗜酸性。位于基因amy内部 +1174～+32 88bp的基因片段amy′全长 2 115bp ,编码 70 5个氨基酸 ,在E .coli表达后依然具有淀粉酶的活性。

酸性α-淀粉酶生产菌株的筛选和酶的纯化及酶的性质研究

从土壤中筛选得到一产酸性α-淀粉酶的野生青霉菌株,对其所产酸性α-淀粉酶进行分离纯化,该酶反应的最适pH值为4.4,最适温度为60℃,分子量约为85kD。薄层层析结果表明该酶水解淀粉生成糊精和多种低聚糖。

耐酸性α-淀粉酶的开发与应用

概述了耐酸性α-淀粉酶的基本性质及在发酵、纺织、饲料、医药等领域中的应用,介绍了国内外对产酸性α-淀粉酶菌株的研究进展,提出了耐酸性α-淀粉酶的开发前景。

白曲耐酸性α-淀粉酶的分离和纯化

从白曲霉菌A .Kawachii的米曲粗抽出液中 ,通过乙醇沉淀、离子交换层析、凝胶过滤层析等方式 ,获得了两个耐酸性α -淀粉酶比活性极高的组分 ,经SDS -PAGE分析 ,推断其组分A分子量为 85 ,0 0 0 ,组分B分子量为10 4 ,0 0 0。两组分均为糖蛋白 ,且能被枯草杆菌蛋白酶 (Subtilisin)适度降解。其N -末端 10 - 12残基的氨基酸序列与黑曲霉A .niger的耐酸性α -淀粉酶N -末端氨基酸序列极为相似。借此推断 ,A .Kawachii的白曲中至少有两种以上的耐酸性α

耐酸性α-淀粉酶产生菌筛选及培养基优化

从酒曲中筛选得到1株产耐酸性α-淀粉酶的菌株,经26S rDNA鉴定为小孢根霉(Rhizopus microsporus var)。通过单因素试验和响应面分析法对该菌株的培养基组分进行优化,得到最佳的培养基组成为加水量11.156mL,麸皮与豆饼比4.145∶1,MgCl20.0772%。在此条件下培养,酶活达到259.902 U/g干物质。

极端嗜热酸性α-淀粉酶PFA在枯草芽孢杆菌中的高效分泌表达

为探索极端嗜热酸性α-淀粉酶PFA在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis WB600)中的高效分泌表达条件,对来源于枯草芽孢杆菌的9种Sec分泌途径信号肽进行筛选,结果显示信号肽Yfk N的引导分泌效率最高。在此基础上,为进一步优化PFA的分泌表达,对信号肽Yfk N的Ile3和Gln4进行饱和突变,并比较不同突变体的引导分泌效率。结果表明突变体I3G/Q4R的引导分泌效率最高,重组枯草芽孢杆菌的胞外α-淀粉酶活力高达715 U/m L。重组α-淀粉酶PFA的最适反应p H值为5.0,最适反应温度为100℃,于100℃的半衰期长达13 h,并且不依赖于Ca^(2+)。结果表明,采用信号肽I3G/Q4R,极端嗜热酸性α-淀粉酶PFA能够在枯草芽孢杆菌中高效分泌表达,这有利于其在淀粉液化工艺中的应用。

快速筛选耐酸性α-淀粉酶生产菌株的平板透明圈法

以可溶性淀粉为底物配制固体培养基,然后低温处理(4℃)平板培养物,产淀粉酶的菌株其菌落周围的培养基由白色变成灰色且透明.该方法不具有破坏性,不需要预先接种菌落,能直接发现和分离分解利用淀粉的微生物.利用淀粉琼脂平板还能快速验证淀粉酶的耐酸性,根据在pH4.2和pH6.0的琼脂平板上透明圈的直径d与淀粉酶活力的对数lnA的关系,求出淀粉酶在pH4.2和pH6.0时的淀粉酶活力.pH4.2时比pH6.0时的比值大,说明该淀粉酶产生菌的耐酸性较强.

一种高温酸性α-淀粉酶基因的高效表达和表达产物分析

一种高温酸性α-淀粉酶基因经密码子优化后在巴斯德毕赤酵母中得到了高效表达,表达的重组α-淀粉酶rBD5063具有α-淀粉酶的活性,表达量达到60mg/L.对rBD5063进行了纯化并对多组分的表达产物进行了研究.rBD5063作用最适pH值为5.0,在pH3.5～10.0范围内酶活性保留50%以上,最适温度在105～110℃之间,在90℃下酶活性半衰期约30min.低浓度Ca2+对激活rBD5063活性和维持稳定性是必需的,高浓度对活性会产生轻微抑制作用,Mg2+、SDS和Trition X-100都能够部分抑制rBD5063活性,Cu2+和EDTA严重抑制rBD5063活性.表达产物水解可溶性淀粉主要产物是单糖和低聚寡糖.表达产物包括分子量分别是62、56、44kD的3种活性组分,在通常情况下主要以大分子量活性多聚体的形式存在.重组α-淀粉酶rBD5063不存在N-连接的糖基化,但是存在O-连接的糖基化现象,O-连接对rBD5063的热稳定性和最适温度没有显著影响.

耐酸性α-淀粉酶产生菌的选育

从醋醅中筛选得到一株产耐酸性α-淀粉酶的野生菌ASA-1,经初步鉴定为假丝酵母属的水生假丝酵母(Candidaaquatica),以ASA-1为出发菌株,通过紫外诱变(UV)和硫酸二乙酯(DES)复合诱变,获得产酶较高的ASA-UD86菌株,酶活达到146u/g。

耐酸性α-淀粉酶的分离提取及性质研究

目的以选育得到的耐酸性α-淀粉酶生产菌株黑曲霉Tx-78为出发菌株,对耐酸性α-淀粉酶的分离提取方法及其性质进行研究。方法通过液体发酵、减压浓缩及进一步提取得到粗酶制剂,对其最适宜反应温度、pH进行测定,对其稳定性及动力学性质进行研究。通过薄层层析对其水解淀粉的最终产物进行分析。结果该酶最适宜反应pH为4.0,最适宜反应温度为70℃。当Ca2+浓度为7 mmol/L时其作用最明显。动力学研究表明该酶的Km值为7.89 g/L。薄层层析结果表明,该酶制剂水解淀粉最终产物为麦芽糖和葡萄糖。结论该酶具有良好的耐酸性和耐热性,Ca2+对其有促进作用,能够实现在酸性条件下淀粉液化和糖化的同步进行,具有良好的应用前景。

黑曲霉酸性α-淀粉酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

以黑曲霉Aspergillus niger基因组DNA为模板,PCR扩增出酸性α-淀粉酶的结构基因,将此基因插入载体pPIC9K,重组质粒pPIC9K-asAA转化毕赤酵母SMD1168,并通过G418平板培养基筛选高拷贝转化子。在酵母α-Factor及AOX1基因启动子和终止信号的调控下,酸性α-淀粉酶大量表达并分泌到胞外,该酶的表达受甲醇的严格调控和诱导,摇瓶培养中,2%甲醇诱导培养168h后酶活力达到最大值2838U/mL。SDS-PAGE结果显示该重组酶的分子质量为58kD。该酶的最适反应pH值为4.0,在pH3.0～6.0之间酶活力基本保持稳定,最适反应温度为70℃,在工业生产常用温度50℃条件下,该酶能够长时间保持稳定,并具有较高的酶活力。重组毕赤酵母遗传稳定性良好。

超耐热酸性α-淀粉酶基因的克隆及其在酵母细胞中的表达

用PCR方法扩增来源于极端嗜热厌氧古菌Pyrococcus furiosus中的超耐热酸性α-淀粉酶的结构基因，将该结构基因引入载体pPIC9K中，将重组质粒pPIC9K—Amy转化大肠杆菌DH5α细胞，测序结果表明，克隆到的α-淀粉酶结构基因为1305bp，其编码的成熟肽为435个氨基酸。将正确构建的重组质粒转化毕赤酵母GS115细胞，得到酵母工程菌株。在酵母α-Factor及AOX1基因启动子和终止信号的调控下，超耐热酸性α-淀粉酶在甲醇酵母中大量表达并分泌到胞外，该酶的表达受甲醇的严格调控和诱导，随着诱导培养时间的增加，在培养基上清液中的单位体积酶活力相应上升，在诱导培养7d后酶活力达到最大值。该酶最适反应温度为90-100℃，最适反应pH值为4．5—5．5。该酶具有非常好的温度稳定性，在100℃条件下热处理5h。仍具有60％以上的酶活力。该酶的这些优点使其非常适于在工业生产上应用。

黑曲霉Tx-78耐酸性α-淀粉酶的分离纯化及其性质研究

从酒曲中选育得到产耐酸性α-淀粉酶的嗜酸性黑曲霉菌株Tx-78,经酒精沉淀,CM52和DE52纤维素离子交换层析对该酶进行纯化,通过SDS-PAGE检验其纯度并测得其分子量为74 ku。该耐酸性α-淀粉酶具有显著的热稳定性及酸稳定性,其最适反应温度与pH分别为70℃和pH 4.0。当反应温度低于60℃时,该酶在pH 4.0条件下可保持稳定活性达3 h以上。Ca2+、Ba2+对提高酶活力具有明显作用。薄层层析表明该酶制剂水解淀粉最终产物主要为麦芽糖和葡萄糖。

一株产酸性α-淀粉酶菌株的筛选及酶学性质研究

从酿造大曲中筛选到高产α-淀粉酶菌株A-5-3,对其进行生物学鉴定,鉴定结果为黑曲霉;对其发酵液进行酶学性质初步研究,结果表明：该酶的最适pH值为3.6,最适温度为70℃,热稳定性良好.在pH3.0～5.0之间,具有很好的酸稳定性且为非Ca2＋依赖型水解酶,在工业生产上有良好的应用前景.

产耐酸性α-淀粉酶菌株固态发酵条件的优化

对产耐酸性α-淀粉酶黑曲霉菌株AS-Y的固态发酵条件进行了优化。经过单因素实验和正交试验,影响产耐酸性α-淀粉酶的菌株产酶量的主要因素为含水量>接种量>附加氮源>Ca2+。固体发酵条件中,水:麸皮为1∶1,麸皮量为15g,接种量为4mL,温度为30℃～32℃。发酵培养基中,麸皮:硫酸铵为1:0.05,CaCl2为0.01g。在上述最佳的发酵条件下,确定其固体发酵时间为60h～72h,酶活达到286.64U/g。

酸性α-淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌中的高效表达

酸性α-淀粉酶是发酵行业用量最大的酶类,为了实现酸性α-淀粉酶基因的高效表达,将本实验室已经克隆得到的去信号肽的酸性α-淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌WB600宿主中进行表达,成功的构建了表达菌株pHT43-amy/WB600。在初始菌浓度OD600为0.8时加入终浓度为0.9 mmol/L的IPTG,诱导6 h的条件下测得酶活力为1 230 U/mL,又由于宿主菌WB600外分泌蛋白较少,因此具有明显的生产优势。