基于酸性磷酸酯酶的生物化学综合性实验设计

本实验以酸性磷酸酯酶为研究对象,分为酶的提取、酶活检测、酶促动力学曲线测定、双倒数作图法测定Vmax和Km值和SDS-PAGE测定蛋白分子量五个部分。学生通过准备实验材料、使用仪器设备和处理化学污染物等过程,培养了职业规范、工程意识和环保意识;通过分析实验数据和优化实验过程,培养了发现和分析问题的能力;通过课堂教师思政引领、案例分析和改进实验方案,加深了对酶化学知识的理解,提高了运用科学思维和生化知识解决问题的能力。

刺参酸性磷酸酯酶的分离纯化及部分性质研究

以刺参内脏为原料提取一种酸性磷酸酶(ACPase,EC.3.1.3.2),进一步用硫酸铵沉淀分离,Sephadex G-200柱纯化,经聚丙烯酰胺凝胶电泳为单一酶带。该酶紫外最大吸收峰波长为220nm和280nm,荧光发射波长在300nm处,激发峰为306.3nm和606.3nm,等电点为4.2,该酶水解对硝基苯磷酸二钠(pNPP)最适pH值为4.4,最适温度为45℃,酶促反应初速度为0.2591μmol/min,米氏常数Km值为0.816×10-4mol/L。重金属Hg2+、Ag+、Cd2+和Pb2+对该酶有明显的抑制作用,其中Hg2+对该酶的抑制作用最强,抑制程度依次为:Hg2+>Ag+>Pb2+>Cd2+。

草鱼酸性磷酸酯酶的性质及金属离子对其活性的影响

以草鱼肝脏为材料提取一种酸性磷酸酯酶(ACPase,EC.3.1.3.2),进一步用(NH4)2SO4沉淀分离,Sephadex G-200柱纯化,经聚丙烯酰胺凝胶电泳纯度鉴定呈现单一酶蛋白带,该酶紫外吸收峰为240nm和280nm,等电点为4.8,相对分子质量为100046.1。该酶水解对硝基苯磷酸二钠(pNPP)的最适pH值为4.4,最适温度为45℃,并有热激活现象,热激活温度为60℃。耐热实验表明,该酶在最适温度下耐热时间为33min,最适温度下20min时表现出最大活性。在60℃下耐热时间为25min,15min时表现最大活性。酶促反应初速度为0.0475μmol/min,最大反应速度为0.153μmol/min。米氏常数Km值为3.56×10-3mol/L。金属离子对酶活性影响的研究结果表明,K+对酶有激活作用,Li+、Na+对酶的活性没有明显影响;碱土金属离子Mg2+、Ca2+和Ba2+对酶有激活作用,其激活程度由大到小依次为:Ba2+、Mg2+、Ca2+;Mn2+对酶有激活作用,Zn2+、Cu2+、Co2+则有抑制作用;重金属离子Hg2+、Pb2+、Ag+和Cd2+对酶有抑制作用,其中Hg2+的抑制效应最强。Mg2+和Cu2+的作用机制研究结果表明,Mg2+对酶具有混合型激活作用,Cu2+对酶具有竞争性抑制作用。

干旱对玉米叶SOD、CAT及酸性磷酸酯酶活性的影响(简报)

干旱条件下玉米叶中SOD、CAT活性下降，酸性磷酸酯酶活性增强，MDA和可溶性磷含量增加，膜脂肪酸不饱和指数下降，膜透性增大。轻度干旱对玉米叶细胞膜无损伤。在恢复供水条件下中度干旱造成的伤害有一定程度的恢复，重度干旱的恢复程度则较小。

羧酸酯酶和酸性磷酸酯酶在抗有机磷和敏感淡色库蚊发育期的变化

本文研讨羧酸酯酶(CarE)和酸性磷酸酯酶(ApE)在抗马拉硫磷(RM)、抗敌百虫(RD)和敏感(s)品系淡色库蚊Culex pipiens pallens不同发育期中的变化,以及某些杀虫剂和抑制剂对α-醋酸萘酯羧酸酯酶(α-NA CarE)的抑制作用。RD和s品系不同发育期的ApE变化情况如下:(1)RD和S品系间无明显差异;(2)幼虫发育期的ApE水平较低,而在变态期的ApE活性突然上升为最高,表明ApE可能参与蚊虫的发育和分化。RM、RD和S品系的CarE水平在幼虫期随虫龄增长而增高。RM和S品系的CarE活性比维持在20—35倍,RD品系在10—25倍,但三个品系的CarE活性在变态期突然下降。新羽化成蚊的CarE活性出现一个很高的峰。羽化后十天内CarE活性有一定的波动,十天后CarE活性逐渐下降,但仍高于幼虫期和蛹期。此外还讨论了对氧磷、敌敌畏、速灭威、毒扁豆碱、TPP和异稻瘟净对RM、RD和S品系α-NA CarE的抑制作用。

大豆磷酸烯醇式丙酮酸磷酸酯酶研究 Ⅲ、非专一性酸性磷酸酯酶的纯化与特性

从大豆叶片中分离能水解磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)的酸性磷酸酯酶,通过硫酸胺分部(20%～50%饱和度)沉淀、DEAE纤维素层析、刀豆球蛋白琼脂糖凝胶亲和层析将酶纯化了422.47倍,活性达78.16U/mg蛋白。该酶对PEP专一性不强,Km为1.09mmol/L(PEP),最适pH5.8,在pH4.8～7.0范围内及60℃以下较稳定,水解PEP的活性被Mg2+、Mn2+激活,F、Cu2+、Zn2+、PO43、MoO42及3磷酸甘油酸(3PGA)、三磷酸腺苷ATP等代谢物抑制,受异柠檬酸等有机酸影响较小。

木豆种子酸性磷酸酯酶AcPase I的部分纯化和动力学特性

以萌发的木豆种子为材料,经过匀浆、硫酸铵分部（20%-60%饱和度）沉淀、DEAE-Sephadex A25离子交换与凝胶柱层析,可得到两个酶活力峰AcPase I和AcPase。将AcPase I过HA和ConA-Sepharose 4B柱层析后,被纯化了51.3倍,比活性为10.80U/mg。AcPase I经PAGE和SDS-PAGE分析都呈现单一蛋白酶带,证明Ac-Pase I是单亚基蛋白酶,其亚基分子量约为32kDa。以对硝基苯磷酸作底物时,AcPase I最适pH为4.0,最适温度为50℃,Km为2.48mmol/L,专一性常数为1.47U/mM.mg,AcPase I对焦磷酸有最小的米氏常数0.15mmol/L,有最大的专一性常数74.63 U/mM.mg。因此,AcPase I的这些动力学特性可为今后进一步研究提供理论依据。

杂色鲍紫色酸性磷酸酯酶基因克隆及应激下的表达

利用本实验室获得的杂色鲍(Haliotis diversicolor)转录组测序数据库,筛选出杂色鲍紫色酸性磷酸酯酶(Purple acid phosphatase,PAP)同源片段,进而克隆获得PAP的cDNA全序列,命名为HdPAP,并进行了HdPAP蛋白的结构分析和功能预测,同时利用实时定量PCR(qRT-PCR)技术分析HdPAP基因的组织表达谱和应激条件下的HdPAP表达变化。HdPAP基因cDNA全长1 215 bp,含有1个编码322个氨基酸的969 bp的开放阅读框。经Blast比对,与无脊椎动物半索动物门囊舌虫(Saccoglossus kowalevskii)的PAP氨基酸序列一致性最高,达59%。通过实时定量PCR检测,HdPAP在检测的杂色鲍各组织中均有表达,其中在血细胞和肝胰腺的表达量显著高于其他各组织(P<0.05)。高温应激下,在检测的6个时相中,HdPAP在血细胞、肝胰腺和鳃中均出现不同程度的表达抑制。缺氧应激后,4 h血细胞中HdPAP显著低于对照组,24 h恢复到正常水平,96 h显著高于对照组(P<0.05),到192 h又恢复到正常水平。副溶血弧菌感染实验中检测到HdPAP在血细胞中同样出现表达抑制现象,3 h和6 h均检测到感染组HdPAP表达量显著低于对照组(P<0.05)。PAP在高温、缺氧及弧菌感染下显著的表达抑制从转录水平揭示了其作为表达下调的酯酶可能参与胁迫下的生物代谢和免疫反应。

德国小蠊羧酸酯酶、酸性磷酸酯酶和碱性磷酸酯酶的活力与抗药性的关系

目的 :了解德国小蠊的羧酸酯酶 (β NACarE)、酸性磷酸酯酶 (ApE)和碱性磷酸酯酶 (BpE)与抗药性的关系。 方法 :采用聚丙烯酰胺凝胶电泳和分光光度法。结果 :(1)Rp品系的 β NACarE活力明显高于S品系 ;(2 )Rp、Rc、Rz品系的ApE和BpE的活力均明显高于S品系。 结论 :(1)德国小蠊对拟除虫菊酯和有机磷的抗性与羧酸酯酶的活力增强有关 ;(2 )酸性磷酸酯酶和碱性磷酸酯酶可能与拟除虫菊酯的抗性有关 ,而与有机磷的抗性无关 ,但此结论还有待进一步探讨。

萌发木豆种子中酸性磷酸酯酶的纯化和动力学特性(英文)

以对硝基苯磷酸为底物检测酶活性,通过20%～60%硫酸铵分部、DEAE-葡聚糖A25、羟基磷灰石、伴刀豆球蛋白-琼脂糖4B柱层析,从木豆萌发的种子中纯化到一个同工酶APaseⅡ,酶最终纯化倍数为247倍,比活力达51.8U/mg蛋白。非变性PAGE和SDS-PAGE表明所纯化的酶已经达到电泳纯,是一个分子量为33.1kDa的单体蛋白。APII的最适pH为5.0,最适温度为35℃,在pH3.5～7以及55℃以下稳定。该酶对焦磷酸有最大活性,受K+和Mg2+激活,受Fe2+,Mn2+,Mo7O246-,F-及酒石酸、苹果酸、异柠檬酸、草酸、柠檬酸、乙醇酸、乙醛酸和抗坏血酸等有机酸抑制。

黑麦基因组中不同染色体在缺磷胁迫下对普通小麦根系分泌酸性磷酸酯酶(Acph)遗传效应的研究

以一整套中国春－帝国黑麦二体附加系为材料，通过在低磷胁迫下对其根系分泌Ａｃｐｈ 能力测定及同工酶等电聚焦分析证明：缺磷胁迫是Ａｃｐｈ基因表达的诱导因子，帝国黑麦不同染色体在中国春小麦背景中对其根系在低磷胁迫下 Ａｃｐｈ的分泌具不同的正效应，其中以 １Ｒ 染色体的效应最为强烈， Ａｃｐｈ等电聚焦（ＩＥＦ）的酶谱清楚地表明黑麦的１Ｒ染色体上携有在缺磷胁迫下诱导表达的Ａｃｐｈ基因。

朱砂叶螨酸性磷酸酯酶测定条件的研究

应用最优４因子组合测定朱砂叶螨（Ｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓｃｉｎｎａｂａｒｉｎｕｓ（Ｂｏｉｓｄｕｖａｌ）酸性磷酸酯酶，并进行了主因子效应分析。结果表明，在醋酸缓冲液ｐＨ值４．４、反应温度４２℃、温浴４０ｍｉｎ、底物８．５×１０－３ｍｏｌ／Ｌ的组合条件，波长４０５ｎｍ下，该酶吸收值最大。

文昌鱼酸性磷酸酯酶色氨酸残基的修饰

从厦门文昌鱼(Branchiostonia belcheri Gary)分离纯化获得聚丙烯酰胺胶电泳单一蛋白区带的酸性磷酸酯酶(EC3.1,3.2)应用化学修饰方法,荧光以及紫外-可见光谱的变化,探讨Trp残基与酶活力的关系,被NBS修饰的Trp基团仅有一个Trp残基被氧化时,酶活力丧失90％,该Trp残基为ACPase表现活力所必需,而且优先被氧化、从光谱扫描(230～600nm)结果表明,经NBS修饰以后的酶构象发生变化,文昌鱼ACPase的Trp残基和酶分子上的铁离子等基团均为酶活力的必需基团,推测两者可能以配位结合,共同维持酶活力中心的构象。

禾谷镰刀菌的酯酶和酸性磷酸酯酶同功酶电泳分析

对来自不同小麦栽培区的 38个禾谷镰刀菌菌株进行了酯酶、酸性磷酸酯酶的电泳分析 .结果表明 ,禾谷镰刀菌具有 3条标志性酯酶带 .根据其变化特点 ,供试菌株的酯酶同功酶谱可划分为 5种类型 .其中类型 1为主体型 ,占总测菌株数的76 3% ;其它类型为少数型 ,分别占总测菌株数的 10 5 % ,2 6 % ,5 2 % ,5 2 % ;类型 5为新出现的谱型 .禾谷镰刀菌具有 2条标志性酸性磷酸酯酶酶带 ,以其出现与否划分供试禾谷镰刀菌菌株为 2种酶谱类型 ,分别占供试菌株总数的 36 8%与6 3 2 %

盐酸胍对文昌鱼Branchiostoma belcheri(Gray)酸性磷酸酯酶构象与活力的影响

本文报告了文昌鱼酸性磷酸酯酶在不同浓度的盐酸胍作用下酶的构象与催化活力变化的关系。盐酸胍浓度在1mol/dm^3时,酶活力提高50%.随着盐酸胍浓度提高(2～4mol/dm^3),酶活力下降,荧光强度也下降,荧光发射光谱λ_(max)值明显红移(330～358nm)。测其变性及失活动力学常数,结果表明,酶的失活速度大于变性速度,表现为慢构象变化、快活力变化的一种模式。在盐酸胍3～4mol/dm^3时,酶的变性与失活过程表现为两个一级反应过程(快相和慢相),其构象与催化活力的变化表明AC-Pase 与活力部位相关的色氨酸残基微环境产生了变化。

德国小蠊酸性磷酸酯酶测定条件的方法研究

[目的]探索德国小蠊(Blattella germanica)酸性磷酸酯酶的最佳测定条件。[方法]采用二次回归通用旋转组合设计方法建立德国小蠊酸性磷酸酯酶测定中缓冲液pH值、反应温度、水浴时间、底物浓度等测定条件的数学模型,根据该模型寻求测定条件的最优组合。[结果]本次试验得到回归方程(?)=0.18157-0.01208x_1+0.02875x_2+0.02558x_3- 0.00383x_4+0.001x_1x_2-0.00613x_1x_3+0.000625x_1x_4+0.01063x_2x_3+0.000125x_2x_4+0.00025x_3x_4-0.00837x_1~2-0.00262x_2~2- 0.00475x_3~2-0.00987x_4~2(R^2=0.9156,Se=0.00061257)。方程的失拟性检验F=3.59<F_005(10.6)=4.06(P>0.05);回归方程的显著性检验F=12.39>F_0.01(14.16)=3.45(P<0.000 1);表明模型合适,二次回归方程有统计学意义。[结论]德国小蠊酸性磷酸酯酶的最佳测定条件是在波长400nm下醋酸缓冲液pH值为4.42、反应温度为47℃、水浴50min、底物浓度为7.5×10^(-3)mol/L。

氟化钠对大豆酸性磷酸酯酶的抑制动力学研究

以对硝基苯磷酸二钠为底物，研究了大豆体外酸性磷酸酯酶的酶促反应动力学和氟化钠对该酶的抑制动力学特性，实验结果表明，大豆酸性磷酸酯酶的酶促反应初速度时间范围为０～２０ｍｉｎ，最适ｐＨ５．６，最适反应温度为３７℃，米氏常数（Ｋｍ）为２．７８×１０－４ｍｏｌ／Ｌ，最适反应速度（Ｖｍ）为１．１５×１０－８ｍｏｌ／ｍｉｎ．ＮａＦ对大豆体外酸性磷酸酯酶有明显抑制作用，属于非竞争性可逆抑制类型，其抑制常数（Ｋｉ）为１．５３×１０－３ｍｏｌ／Ｌ．此外，还探讨了ＮａＦ的抑制机理．

汞对小麦幼苗生长及酸性磷酸酯酶和过氧化物酶的影响

本研究通过用汞溶液培养小麦幼苗进行观察和测试,结果发现,不同浓度的汞可抑制小麦幼苗的生长,促进幼苗的酸性磷酸酯酶和过氧化物酶的活性。低浓度汞可使根的过氧化物酶同工酶酶带活性增强,而高浓度汞(10.15ppm)不仅使酶带活性增强,还能诱发产生新的酶带和使原有的酶带消失。

大麦芽中酸性磷酸酯酶的分离及性质

经水抽提、乙醇沉淀及 DEAE—Sephadex A—50离子交换层析,从大麦芽中分离出酸性磷酸酯酶.酶比活力达1000u/mg.pr,经 SDS—PAGE 分析,该酶显示单一电泳染色带,分子量约为71kd,经聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦测定,该酶等电点约为5.6.

酵母酸性磷酸酯酶基因表达与细胞周期活动

酵母酸性磷酸酯酶基因表达与细胞周期活动敖世洲（中国科学院上海生物化学研究所上海２０００３１）酵母酸性磷酸酯酶基因家族是一个复杂的系统，其中包括４个结构基因：ＰＨＯ３、ＰＨＯＳ、ＰＨＯ１０和ＰＨＯｌｌ，分别编码不同的酸性磷酸酯酸。ＰＨＯ５、ＰＨＯ１０和...