致儿童咽扁桃体炎酿脓链球菌emm分型

目的分析导致儿童咽扁桃体炎的酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes),即A族β溶血性链球菌(group A streptococcus,GAS)的emm分型。方法 2007年1—12月共获取119株GAS,分别来自于重庆(42株)、深圳(30株)和上海(47株)3个地区。应用多聚合酶链反应(PCR)扩增编码成熟M蛋白基因(emm基因)。对PCR扩增后的emm基因产物进行测序,并将所测得的emm基因序列提交到相关网站,获取emm分型结果。结果共有13种emm型GAS可导致儿童发生咽扁桃体炎:emm1.0(24.37%),emm3.1(0.83%),emm4.0(0.83%),emm6.5(1.68%),emm12.0(55.46%),emm22.0(10.08%),emm63.0(0.83%),emm77.0(0.83%),emm80.0(0.83%),emm102.2(1.68%),emm104.0(0.83%),st1815.0(0.83%)和stG485.0(0.83%)。重庆地区可见10种emm分型:emm1.0(11.90%),emm3.1(2.38%),emm6.5(4.76%),emm12.0(61.90%),emm22.0(4.76%),emm63.0(2.38%),emm80.0(2.38%),emm102.2(4.76%),st1815.0(2.38%)和stG485.0(2.38%)。深圳地区可见5种emm分型:emm1.0(16.67%),emm12.0(50.00%),emm22.0(26.67%),emm77.0(3.33%)和emm104.0(3.33%)。上海地区可见4种emm分型:emm1.0(40.42%),emm4.0(2.13%),emm12.0(53.19%)和emm22.0(4.26%)。结论 emm1.0、emm12.0和emm22.0克隆流行菌株是最常见的导致重庆、深圳和上海3地区儿童发生咽扁桃体炎的酿脓链球菌。3地区导致儿童发生咽扁桃体炎的克隆流行菌株存在差别。

酿脓链球菌对大环内酯类抗菌药物耐药表型与基因型研究

目的研究酿脓链球菌对大环内酯类抗菌药物的耐药表型与基因型。方法采用琼脂平板稀释法测定97株酿脓链球菌对红霉素、克林霉素、麦迪霉素、阿奇霉素、克拉霉素和青霉素的敏感性;用双纸片法检测酿脓链球菌耐药表型;用PCR方法检测耐大环内酯的酿脓链球菌携带的耐药基因。结果97株酿脓链球菌中82株表现为对大环内酯类抗菌药物不敏感,其中42株表现为cMLS型耐药,37株为iMLS型耐药,3株细菌为主动外排M型耐药;82株对大环内酯不敏感的酿脓链球菌中77株检测到耐药基因,其中12株具有ermB基因,25株具有ermTR基因,2株具有mefA基因,21株同时具有ermB/ermTR基因,5株同时具有ermB/mefA基因,3株同时具有ermTR/mefA基因,9株同时具有ermB/ermTR/mefA基因,5株未能检测到三种耐药基因。结论酿脓链球菌对大环内酯类抗菌药物的耐药率较高,耐药表型以cMLS和iMLS为主,耐药基因以ermB和ermTR多见。

应用实时荧光PCR法检测食品中的酿脓链球菌

目的:建立一种简单、快速、准确的检测酿脓链球菌的方法,为食品中酿脓链球菌的检测提供依据和便利。方法:实验采用Taq Man探针法,针对酿脓链球菌DNase B基因设计引物探针,用特异性实验、灵敏性实验、模拟样品实验对该方法进行验证。结果:该实时荧光PCR体系的特异性良好,酿脓链球菌的DNA扩增结果为阳性,链球菌属的其他细菌以及属外的常见菌DNA扩增均为阴性;灵敏性实验和模拟样品试验中最低检出限分别为50和23pg/μL,数量级一致,说明了该PCR体系在对含有肉类食品中酿脓链球菌的检测仍然保持有较高灵敏度。结论:目前国内单独的应用实时荧光PCR法对酿脓链球菌检测的文章比较少,本实验建立了检测酿脓链球菌的实时荧光PCR方法,特异性和灵敏性良好,实验过程省时省力,具有较高应用价值。

酿脓链球菌特异、快速分子检测方法的建立

集中空调内部容易滋生细菌、真菌等微生物,成为有害微生物污染传播和扩散的媒介。为对公共场所空调系统有害微生物酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)进行有效检测与预防,该研究建立该菌的高效、特异的PCR检测方法和重组酶等温扩增(recombinase aided amplification,RAA)结合侧流层析试纸条(lateral flow dipstick,LFD)的快速恒温检测方法。基于序列的相似性比对方法,从酿脓链球菌基因组序列中挖掘到5个特异的DNA区段,长度分别为5348、1098、5287、5369、240 bp。以5369 bp的特异DNA片段为检测靶标,设计PCR引物,优化确定最优退火温度为60.0℃;对PCR引物的特异性进行分析,确定该引物能有效区分酿脓链球菌的多个近缘种;当PCR循环数为25、30、35时,最低可检出400 fg/μL(1.248×105拷贝/μL)、4 fg/μL(1.248×103拷贝/μL)、0.4 fg/μL(1.248×102拷贝/μL)的模板DNA。设计RAA-LFD引物及探针,优化反应体系,确定最优反应温度为37℃;对RAA-LFD引物及探针进行特异性分析,确定该引物能有效区分酿脓链球菌的多个近缘种;当反应时间为5、10、15、20、25 min时,最低可检出400 fg/μL(1.248×105拷贝/μL)、4 fg/μL(1.248×103拷贝/μL)、4×10–1 fg/μL(1.248×102拷贝/μL)、4×10–2 fg/μL(1.248×101拷贝/μL)、4×10–5 fg/μL(1.248×10–2拷贝/μL)。建立的酿脓链球菌的PCR检测体系和RAA-LFD快速检测体系特异性强、灵敏度高、快速高效,为公共场所集中空调系统有害微生物酿脓链球菌的检测、防控提供新的技术选择。

酿脓链球菌生物学特性及其检测方法应用进展

酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)是引起人类细菌感染最重要的病原之一,也是主要食源性致病菌之一。该菌含有多种毒力因子,可引起人的多种疾病。近年来,由酿脓链球菌引起的猩红热和全身侵袭性感染发病率有所上升,引起了世界各国对该类细菌感染的更多关注。综述了酿脓链球菌的生物学特性和检测方法的核心技术特征及应用,包括传统分离鉴定方法、分子生物学方法及免疫学方法等,以便对这一菌种的毒力因子、致病机制进行深入了解,为酿脓链球菌更快速、便捷、灵敏的检测方法的建立及预防相关感染的日化产品的开发提供参考。

广东省猩红热患儿酿脓链球菌病原学特征分析

目的了解广东省不同时期猩红热患儿酿脓链球菌的病原学特征。方法对不同时期广东省酿脓链球菌分离株22株进行emm分型、超抗原基因检测、抗生素敏感性分析和PFGE分子分型。结果酿脓链球菌对头孢噻肟、左旋氧氟沙星和青霉素100％敏感，2000年以后分离的酿脓链球菌对红霉素和克林露素100％耐药，而2000年以前的菌株只有9．1％（1／11）对这两种药物耐药。22株酿脓链球菌有3个emm型：59．09％（13／22）为emml2．0型，36．36％（8／22）为emm6．0型，4．55％（1／22）为emml．0型。2011年和1997年分离的酿脓链球菌为emml2．0型，1978年和1986年分离的菌株为emm6．0型，2008年分离的菌株为emml．0型。超抗原基因speA，speB，speC，speF，speG，speH，sfneZ和ssa的检出率分别为：54．55％、100％、100％、100％、100％、54．55％、0％、86．36％，95．45％的菌株同时携带6个超抗原基因。22株酿脓链球菌可分为10种不同的PFGE型别，分成Ⅰ-Ⅲ3个聚集簇，聚集簇Ⅰ由1997年分离的菌株和1株2011年分离的菌株组成，聚集簇Ⅱ由1978年和1986年分离的菌株组成，聚集簇Ⅲ由9株2011年分离的菌株和1株2008年分离的菌株组成。结论广东省猩红热患儿酿脓链球菌对青霉素敏感，红霉素耐药，emml2．0型为主要emm型，酿脓链球菌的超抗原基刚携带率高。

成人酿脓链球菌导致中毒休克综合征临床分析

目的探讨酿脓链球菌导致毒素休克综合征的致病机制及患者死亡原因。方法研究2例侵袭性酿脓链球菌致坏死性筋膜炎并发毒素休克综合征患者临床资料,对其中1例患者的分离株进行emm基因分型及其超抗原毒素基因的测定。结果患者2感染酿脓链球菌(GAS)产生的emm89型M蛋白,并且同时产生多种超抗原毒素(speG、speI、speK/L、smeZ、ssa、spd1、spd3、spd4、sdn、prtF-15);病例1患者因昏迷、休克,而放弃治疗,病例2患者因多器官功能脏器衰竭死亡。结论我国首例报道由emm89型酿脓链球菌所致严重的侵袭性感染,坏死性筋膜炎伴毒素休克综合征,emm89型酿脓链球菌引起的重症感染应引起有关部门的足够重视,避免形成暴发流行,早期的手术清创以及有效的抗感染、IVIG的使用,是挽救患者的有效手段。

北京地区儿童携带的酿脓链球菌emm分型和超抗原speA及speC的相关性研究

目的分析北京地区儿童携带的酿脓链球菌酿脓链球菌的emm分型及携带超抗原speA及speC基因情况。方法应用PCR对2007年1-12月155株北京地区猩红热、咽扁桃体炎患儿及健康儿童咽部酿脓链球菌emm基因及超抗原speA和speC基因进行扩增。结果健康儿童、猩红热患儿及咽扁桃体炎患儿中有emm1.0(51.6%)、emm4.0(0.6%)、emm12.0(41.3%)、emm18.0(1.9%)、emm22.0(0.6%)、st1815(1.3%)、st5240(0.6%)及stG485(1.9%)8种酿脓链球菌克隆株流行。其中13.5%酿脓链球菌只携带超抗原speA基因,26.5%只携带超抗原speC基因,40.6%同时携带超抗原speA和speC基因,19.4%2种基因均不携带。25.0%emm1.0型酿脓链球菌只携带超抗原speA基因,2.5%emm1.0型和51.6%emm12.0型酿脓链球菌只携带超抗原speC基因,68.8%emm1.0型和12.5%emm12.0型酿脓链球菌同时携带speA及speC基因,3.8%emm1.0型和35.9%emm12.0型酿脓链球菌2种基因均不携带。27.3%致猩红热emm1.0型酿脓链球菌只携带超抗原speA基因,4.5%只携带超抗原speC基因,61.4%同时携带超抗原speA和speC基因,6.8%克隆株2种基因均不携带。18.8%致咽扁桃体炎emm1.0型酿脓链球菌只携带超抗原speA基因,81.2%emm 1.0型酿脓链球菌同时携带超抗原speA和speC基因。50.0%健康儿童携带的emm1.0型酿脓链球菌只携带超抗原speA基因,50.0%同时携带超抗原speA和speC基因。39.1%致猩红热emm12.0型酿脓链球菌只携带超抗原speC基因,17.4%同时携带超抗原speA和speC基因,43.5%2种基因均不携带。73.3%致咽扁桃体炎emm12.0型酿脓链球菌只携带超抗原speC基因,10.0%同时携带超抗原speA和speC基因,16.7%2种基因均不携带。18.2%健康儿童携带的emm12.0型酿脓链球菌只携带超抗原speC基因,9.1%同时携带超抗原speA和speC基因,72.7%2种基因均不携带。结论 emm1.0型和emm12.0型酿脓链球菌是导致北京地区儿童发生猩红热及咽扁桃体炎的2个主要克隆菌株。stG485、emm18.0、emm1.0型和emm12.0型酿脓链球菌是北京地区健康儿童携带的4个主要克隆菌株。不同emm分型酿脓链球菌、致猩红热酿脓链球菌、致急性咽扁桃体炎酿脓链球菌及健康儿童携带的酿脓链球菌对超抗原speA和speC基因携带率各有不同。

深圳儿童酿脓链球菌分离株多基因序列分型

目的探讨酿脓链球菌,即β溶血性A族链球菌(GAS)在深圳的流行病学特征。方法对2016年1月至2018年12月深圳市儿童医院分离的GAS流行克隆群进行多基因序列分型(MLST)回顾性分析。本研究中32株分属于7个不同emm分型的GAS菌株分别来自32例患有脓疱病、蜂窝组织炎、猩红热、脓毒症、肺炎、阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征、支气管炎、过敏性鼻炎、臀部脓肿、过敏性紫癜或咽扁桃体炎的患儿,分离自咽拭子23份,痰液5份,脓液3份和血液1份。应用聚合酶链反应技术对32株GAS菌株的7对等位看家基因(gki、gtr、murI、mutS、recP、xpt和yqiL)进行扩增,对目标基因产物进行测序。然后将获得的每个等位基因的基因序列提交至MLST网站,以获得相应的等位基因谱。最后将等位基因谱再次提交至MLST网站,以确认序列分型(ST)。结果emm 1.00及其亚型、emm 4.00、emm 12.00及其亚型、emm 22.00、emm 28.00、emm 75.00和emm 89.00的GAS克隆群分别属于MLST分型中的ST28、ST39、ST36、ST46、ST52、ST49和ST921。结论2016年至2018年导致深圳地区儿童感染的GAS分离株的MLST流行克隆群分别为ST28、ST39、ST36、ST46、ST52、ST49和ST921。

2011年至2013年北京市海淀区羊坊店社区儿童咽扁桃体炎酿脓链球菌分子生物学特征

目的分析致北京市海淀区羊坊店社区儿童咽扁桃体炎酿脓链球菌（GAS）分子生物学特征。方法2011年4月至2013年4月首都医科大学附属北京世纪坛医院门诊诊治咽扁桃体炎患儿94例，获取17株GAS。应用多聚酶链反应（PCR）扩增编码成熟M蛋白基因（encoding mature Mprotein gene，emm gene），7对等位看家基因gki、gtr、murl、rets、recP、xpt及yqiL，超抗原speA及speC基因，大环内酯类耐药基因ermB、mefa及ermRT。对emm基因及7对等位看家基因PCR扩增产物进行测序。将所测得的emm基因序列提交到美国疾病控制中心网站，获取emm分型。将所测得的7对等位看家基因序列发送到美国多位点序列分型（MLST）网站，获取等位基因谱，以确定序列分型（ST）。对超抗原基因speA及speC和耐药基因ermB、mefA及ermRT的PCR产物进行凝胶电泳，获取相应的定性结果。结果本研究共发现emml2．0（76．4％），emml．0（5．9％），emm89．D（5．9％），emm75．0（5．9％）和emm22．0（5．9％）5种emm基因分型GAS克隆株流行；emml2．0型及其亚型GAS等位基因谱属于ST36型；emml．0型GAS等伊基因谱属于ST28型；emm89．0型GAS等位基因谱属于STl01型；emm75．0型GAS等位基因谱属于ST49型；emm22．0型GAS等位基因谱属于ST46型；其中大环内酯类耐药基因ermB的携带率为94．1％（16／17例），mefA及ermRT的携带率为0；超抗原speA基因携带率为0，超抗原speC基因携带率为100．0％（17／17例）。结论emml2．0（ST36）型GAS是2011年至2013年致北京市海淀区羊坊店社区儿童咽扁桃体炎最常见的流行克隆菌株，主要携带大环内酯类耐药基因ermB及超抗原基因speC．

儿科咽拭子检出酿脓链球菌的耐药性分析

酿脓链球菌是一种致病力强的致病菌,产生多种毒素,幼儿感染居首位。1材料与方法1.1菌株来源56株酿脓链球菌由我院微生物室分离,系自2010年1月-2011年12月儿科咽拭子标本,标本包括门诊及病房,均以每例1次记,无重复菌株。1.2试剂0.04U杆菌肽纸片、链球菌MIC药敏板（天津金章）,血清分型试剂（法国生物梅里埃公司）。

酿脓链球菌Cas9核酸酶的重组表达、分离纯化及酶学特性

【背景】Cas9核酸酶是一种RNA引导的核酸内切酶,可与单链向导RNA(single-guide RNA,sgRNA)形成稳定的核糖核蛋白复合物,识别和切割特定的核苷酸片段。由于其具备高灵活性和高效率的特点,目前已经成为基础科学研究领域和临床治疗方法中使用最广泛的基因编辑工具。【目的】为Cas9核酸酶的合理开发和利用提供理论依据。【方法】利用大肠杆菌表达系统表达野生型酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)Cas9核酸酶,经硫酸铵沉淀和镍柱亲和层析两步纯化获得较高纯度表达产物,并对其热稳定性、pH稳定性、金属离子的影响等酶学特性进行研究。【结果】经高密度发酵后,大肠杆菌湿菌重达191.0 g/L。纯化后酿脓链球菌Cas9核酸酶的比酶活达641.29 U/mg,纯化倍数为16.02,收率为46.40%。Cas9核酸酶在25-42°C保温2 h后剩余酶活保持在65%以上,而在45°C保温15 min后全部失活;其在pH 6.0-10.0范围内稳定性较高,剩余酶活大于68%,在pH9.0时稳定性最高;0.5-20.0mmol/L浓度范围内的Mg^2+对该酶有激活作用,10.0 mmol/L的Mg^2+可使该酶酶活力提高约23%;Ba^2+、Co^2+、Ca^2+、Mn^2+、Cu^2+、Fe^2+、Zn^2+对该酶有不同程度的抑制作用,其中0.5 mmol/L的Cu^2+和Fe^2+对Cas9核酸酶有完全抑制作用。【结论】异源表达并纯化出具有较高纯度和较高酶活力的酿脓链球菌Cas9核酸酶,并对其酶学特性进行了初步研究,该结果对CRISPR/Cas9技术的进一步推广和应用有一定的指导意义。

一种可快速检测食品中酿脓链球菌和无乳链球菌的RPA方法的建立

为了实现食品中酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)和无乳链球菌(S.agalactiae)快速、高效检测,本研究建立了一种同时快速检测食品中这两种细菌的方法。本研究基于重组酶聚合酶等温扩增技术(recombinase polymerase amplification,RPA)原理,选择酿脓链球菌致热外毒素B基因(speB基因)和无乳链球菌表面免疫蛋白基因(SIP基因)的保守序列分别设计RPA引物和探针,分析检测方法的特异性和灵敏性,采用模拟污染实验验证检测效果。结果表明,检测时间为20 min;酿脓链球菌和无乳链球菌分别对speB和SIP基因检测结果为阳性,其他链球菌和非链球菌检测结果为阴性;方法对speB和SIP基因的检出限均可达100copies/反应;酿脓链球菌和无乳链球菌低菌量污染的样品增菌液,在经过短暂几小时的增菌培养后可被检出阳性信号。本研究建立的检测方法快速、准确、灵敏,可同时作为食品中酿脓链球菌、无乳链球菌的快速检测方法,具有较强的应用价值。

A族链球菌M蛋白相关疫苗的研究进展

A族链球菌（group A streptococcus,GAS）也称化脓性链球菌,是最常见的也是致病性最强的革兰阳性菌之一,其可以引起多种感染性疾病如扁桃体炎、急性咽炎、喉炎、风湿热、猩红热及严重的毒性休克综合征。

灭活A组链球菌全菌体抗原诱导风湿性心脏炎的可行性

【目的】探讨以Lewis大鼠为实验对象,用皮下注射灭活A组链球菌全菌体抗原的方法诱导风湿性心脏炎的可行性。【方法】复活并繁殖A组β溶血性链球菌,细菌用40g/L甲醛液灭活。实验大鼠分为3组:对照组(4只)、模型A组(8只)、模型B组(5只)。模型A组大鼠后足垫注射灭活A组链球菌全菌体抗原/完全弗氏佐剂(CFA)混合液。初次免疫后第1周腹部皮下再次注射上述抗原1次,第3周(第21天)解剖动物。模型B组大鼠初次免疫同模型A组,第1、2、3周腹部皮下重复接受注射上述抗原,第6周(第42天)解剖动物。对照组大鼠后足垫注射生理盐水/CFA混合液,第3周(第21天)解剖动物。观察动物的体质量、足关节炎症程度、抗心肌抗体IgG吸光度,以及心脏、肾脏、肺脏和足关节的病理组织切片。【结果】模型A组大鼠的抗心肌抗体IgG吸光度免疫前、免疫后第2周、第3周分别为0.13(S=0.03)、0.24(S=0.06)和0.27(S=0.03),提示HRAbIgG抗体浓度从免疫后第2周开始呈上升趋势。免疫后第3周,模型A组8只大鼠中有3只心肌间质出现少量的灶性炎症细胞浸润,未观察到心瓣膜炎症变化。模型B组大鼠5只大鼠中有4只心肌间质小血管旁出现较明显的灶性炎症细胞浸润,其中2只观察到心瓣膜炎症。【结论】以Lewis大鼠为对象,使用皮下注射灭活A组链球菌的方法,可以诱发大鼠发生心脏炎。

A群链球菌459株耐药性分析

目的 了解A群链球菌对8种抗生素的耐药性。 方法 将标本接种于含5%去纤维羊血的哥伦比亚琼脂平皿中,在35. 5℃、5%二氧化碳条件下培养,按鉴定手册操作程序进行。药敏试验用含5%去纤维羊血的M H琼脂培养基,按K B法进行,用参考菌株作质量控制。 结果 459株中有3株耐万古霉素, 25株只对万古霉素敏感,其余均耐药;对8种抗生素全敏感的仅32株;对8种抗生素的耐药率分别为红霉素64. 1%,林可霉素61. 2%,青霉素65. 8%,头孢曲松12. 9%,头孢噻肟17. 0%,头孢唑啉22. 0%,万古霉素0. 7%,苯唑西林77. 6%。 结论 治疗本地区A群链球菌感染和对风湿热作一、二级预防宜首选头孢菌素类抗生素。