酿酒酵母ARS304及其侧翼序列重组质粒的构建与鉴定

采用PCR扩增酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Ⅲ号染色体ARS304序列(S1)及以ARS304为核心上下游延伸1 kb的侧翼序列(S2),并将目的片段分别构建到酵母整合载体pRS405中,获得重组质粒pRS1和pRS2。质粒电转化试验发现重组质粒pRS2的转化率大于pRS1,说明ARS304侧翼序列能显著提高ARS304在酿酒酵母中自主复制的能力。

WEB2基因参与酿酒酵母S期检查点调控

WEB2基因编码产物为一种DNA解链酶。WEB2突变株经hydroxyurea阻断DNA合成后,经流式细胞仪检测DNA含量、纺锤体微管间接免疫 荧光染色及存活率测定,结果显示WEB2突变株表现S期检查点缺失。推测WEB2除了具有解链酶作用外,还参与酿酒酵母S期检查点调控机制,位于已建立的S期检查点信号传导通路模型上。本研究有助于加深对真核细胞检查点调控的了解,为研究肿瘤的发生机制提供线索。

WEB2基因在酿酒酵母S期检查点通路上调控RNR3基因表达

WEB2基因参与酿酒酵母S期检查点调控机制,而RNR3基因位于该调控通路末端,DNA损伤或合成阻断时,S期检查点通路诱导RNR3过度表达。因此,通过确定WEB2在该检查点通路上是否参与调控RNR3基因的表达,将有助于进一步明确WEB2基因在检查点通路上的工作位点,了解WEB2基因如何发挥检查点调控功能。构建RNR3-LacZ基因融合质粒,用于检测酵母细胞内RNR3基因的诱导性。诱导性可以通过测定β-半乳糖苷酶的活性而得知。利用DNA损伤药物甲磺酸甲酯(MMS)及DNA合成阻断剂羟基脲(HU)处理酵母细胞,测定WEB2基因突变株和野生株细胞内RNR3基因的诱导性。结果,WEB2突变株细胞中诱导活性分别增加(8.27±0.38)倍和(9.55±0.24)倍,而野生株分别增加了(83.32±2.42)倍和(124.67±2.87)倍。反映RNR3基因在WEB2突变株中的诱导性低于野生株。同RAD53突变株相比,后者的RNR3基因的诱导性更低,仅为(2.37±0.18)倍和(2.91±0.13)倍。说明WEB2基因突变影响S期检查点通路的信号传递至RNR3基因,所以在酿酒酵母S期检查点通路上,WEB2工作在RNR3基因上游,参与调控RNR3的表达,但调控能力不如RAD53基因强。

酿酒酵母ARS305侧翼序列对其自主复制活性的影响

利用PCR技术扩增了酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Ⅲ号染色体上以ARS(Autonomously replicating sequence,ARS)305为核心的不同长度侧翼序列,并将其构建到酵母整合型载体pRS405中获得了重组质粒PA500、PA1000、PA2000,然后通过电转化法转入酿酒酵母细胞中,测定了不同ARS305片段对酵母转化效率及质粒在酵母中稳定性。结果表明,并非侧翼序列越长ARS活性越高,重组质粒PA1000具有比PA2000更高转化频率和转化稳定性,推测ARS两侧序列存在一些顺式和反式的调控机制影响ARS自主复制功能。

酿酒酵母S期检查点通路上web2基因与rad53基因的位置关系

为探讨酿酒酵母(S.cerevisiae)S期检查点通路上,web2(wantsE1Abadly2,web2)基因与rad53基因的上下游位置及相互作用关系,利用羟基脲(hydroxyurea,HU)分别阻断web2突变株和野生株细胞的DNA合成.采用pHA-rad53质粒救助实验测定质粒源性Rad53蛋白是否能救助web2突变株对羟基脲的敏感性;Western印迹及免疫共沉淀反应检测Rad53蛋白表达及磷酸化.结果显示,pHA-rad53质粒可以救助web2突变株的存活;Western印迹检测到web2突变株内质粒源性Rad53蛋白表达增强而且至少Rad53部分蛋白为磷酸化蛋白.说明在HU作用下,过表达并磷酸化的质粒源性Rad53蛋白可以救助web2突变株的S期检查点功能缺陷,在酿酒酵母S期检查点通路上web2基因位于rad53基因上游,可能直接参与将检查点信号传递至Rad53蛋白.

高产酿酒酵母SCY6生长与发酵条件的优化

采用高产酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SCY6发酵葡萄糖产乙醇,设计单因素试验考察该酵母菌株适宜的生长条件,采用正交试验优化酵母发酵产乙醇的条件。结果表明,该酵母菌株的最适生长温度和pH分别为28℃、5.0,培养基中葡萄糖质量分数为15%时其生长状态较好。正交试验结果表明,最适合该酿酒酵母发酵产乙醇的条件为玉米浆和(NH4)2SO4作为氮源,用量分别为20 g/L和2 g/L,接种量为4%,pH 5.0。在此条件下进行发酵,发酵液中乙醇体积分数可达7.77%,葡萄糖转化率达83.82%。

酿酒酵母超氧化物歧化酶的分离纯化研究

酿酒酵母CNU94经发酵培养后,离心收集菌体,将菌体用甲苯法破壁得到的粗酶液调节pH除杂蛋白,丙酮二次沉淀后,用DEAE32纤维素柱层析梯度洗脱,得到纯化的SOD,其比活为3500u/mg,收率为58.3%。PAGE电泳后的活性染色显示,酵母超氧化物歧化酶具4条明显的同功酶。该样品经KCN,H2O2,CHCl3乙醇抑制试验,酶类型为Cu/ZnSOD。

高压脉冲电场对酿酒酵母杀菌效果影响和模型分析研究

研究了高压脉冲电场(pulsed electric field,PEF)对接种于胡萝卜汁中酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae,CGMCC2.604)的杀菌效果并进行了模型分析。结果表明,随电场强度和脉冲时间增加,PEF对酿酒酵母的杀灭效果增强,25kV/cm、2173μs时酿酒酵母降低了4.5个对数。Weibull模型和Log-Logistic模型均能很好的拟合PEF处理酿酒酵母的失活曲线,模型评价参数(Af,Bf,SS,RMSE和R2)分析表明,Log-Logistic模型比Weibull模型能更好地拟合PEF处理下酿酒酵母失活动力学变化。

酿酒酵母的乳酸抗性机制

以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)乳酸抗性单倍体突变株T-27-24(αtrp-ura-)和其亲株T-27(αtrp-ura-)为研究对象,考察于30℃在5%(V/V,下同)乳酸冲击条件下菌体存活率、细胞膜通透性以及菌体积累海藻糖和麦角固醇等方面的情况。结果表明,在5%乳酸冲击下,T-27-24菌体存活率明显高于T-27,且比T-27具有较强的降低细胞受冲击时细胞膜通透性的作用;同时T-27-24对海藻糖和麦角固醇的积累能力都明显高于T-27。因此,T-27-24具有较强的维持细胞膜完整性和积累海藻糖及麦角固醇的能力,这是其具有乳酸抗性的重要原因。

耐高温酿酒酵母木薯乙醇发酵条件的优化

通过单因素试验和正交试验,对耐高温酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)XG-1的木薯乙醇发酵的主要影响因素进行了研究。结果表明,在40℃高温培养条件下,XG-1对乙醇更加敏感,影响其木薯乙醇发酵,而影响木薯乙醇发酵各因素的主次顺序为发酵温度>接种量=发酵时间。木薯乙醇发酵最佳工艺条件为发酵液中木薯淀粉含量200 g/L,氮素[(NH4)2SO4]添加量8 g/L,XG-1接种量约1.0×107CFU/mL,发酵温度33℃,发酵时间72 h,发酵结束时发酵液中乙醇体积分数为13.1%,淀粉利用率为92.0%。

酿酒酵母检测系统的原理、方法和应用

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae,又称啤酒酵母、面包酵母)是子囊型真核微生物。营养要求低,繁殖速度快,遗传背景清楚,是生物学研究的好材料。在基因重组、突变和染色体畸变等方面,酵母和哺乳类比较接近。因而,用酵母筛检环境因子对人类的致突变危害比细菌学方法更合理而可靠。在检测药物能否引起染色体分离异常方面,更是细菌学方法不能替代的。本文就酵母检测系统的原理、方法和应用作些介绍。

重组酿酒酵母表达白斑综合征病毒VP28的保护性初探

目的:构建重组酿酒酵母表达白斑综合征病毒VP28蛋白,并对其口服给药后的保护效率进行分析。方法:以白斑综合征病毒的vp28基因(基因库编号:FJ756456.1)作为研究对象,构建重组酿酒酵母S.cerevisiae EBY100/pYD1-VP28,通过SDS-PAGE、Western blot以及免疫荧光分析对重组酿酒酵母S.cerevisiae EBY100/pYD1-VP28的表达进行检测。以白肢虾(Penaeus vannamei)作为动物模型,通过白斑综合征病毒攻击实验,检测重组酿酒酵母S.cerevisiae EBY100/pYD1-VP28的保护效率。结果:口服重组酿酒酵母EBY100/pYD1-VP28后的对虾存活率为60%。结论:重组酿酒酵母S.cerevisiae EBY100/pYD1-VP28可以应用于对虾养殖业预防白斑综合征病毒的感染,潜藏着巨大的市场应用前景。

国内生物分子学技术应用于酿酒酵母的研究进展

酿酒酵母的运用已广泛存在于人类社会的方方面面。相比于将其作为面包、馒头、酒类产品的发酵菌株,现今的酿酒酵母更是人类用以开发可再生资源而得到燃料乙醇的重要手段。分子生物学与遗传工程技术作为近代迅速发展起来的新兴学科,已大量应用于微生物的研究,如PCR技术、基因重组、原生质体技术等等,在微生物的鉴定筛选、调节产物的生产、基因工程菌的构建等方面发挥了推动作用。以酿酒酵母为参考对象,阐述了国内近年来运用分子生物学技术改造酿酒酵母的研究报道。

大湘西野生猕猴桃酿酒酵母的分离鉴定及其产物ACE抑制活性

通过平板划线、显微镜观察、WL培养基筛选、酒精度及血管紧张素转化酶(Angiotensin converting enzyme,ACE)抑制活性测定,对野生猕猴桃酿酒酵母进行分离筛选,再利用26S rDNA D1/D2区序列分析进行分子生物学鉴定。利用该菌株对野生猕猴桃进行纯种发酵,研究不同发酵阶段中发酵醪液的ACE抑制率、酒精度及多肽浓度变化。结果表明,经分离筛选获得适于猕猴桃果酒发酵的野生酵母JM11为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae),在发酵4 d时发酵醪液的ACE抑制率为(93. 0±2. 6)%,酒精度为(7. 8±0. 5)%Vol,多肽浓度为(2 652. 0±112. 4)μg/mL,说明该菌株可酿制果酒,制得的产品还具有良好的ACE抑制活性,可作为野生猕猴桃降血压型保健果酒发酵的专用菌种或选育野生猕猴桃专用菌种的出发菌株。

整合型酿酒酵母菌株强化发酵和特性比较

为了提高木糖异构酶基因在重组酿酒酵母体内的稳定性,并比较不同真菌来源的木糖异构酶在木糖或者葡萄糖-木糖培养基的发酵利用特性,分别构建来自Piromyces sp.E2和Orpinomyces sp.的木糖异构酶基因的整合表达载体,利用同源重组将其整合进入呼吸缺陷型菌株的18S rDNA非转录区,结果测得Orpinomyces的木糖异构酶酶活活力为0.72 U/mg,比Piromyces的木糖异构酶酶活高2.8倍。在木糖培养基中发酵获得乙醇的得率分别为0.40 g/g和0.48 g/g。且整合入Orpinomyces的木糖异构酶基因菌株能获得最高酶活和乙醇得率。

采用三羧酸循环酶缺陷酿酒酵母生产低醇啤酒

本文研究了采用三羧酸循环酶活缺陷酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）菌株生产低醇啤酒。编码延胡索酸酶和α-酮戊二酸脱氢酶的 FUM1（0.48%）、KGD1（0.42%）和 KGD2（0.48%）基因缺陷的菌株可酿制酒精含量低于0.5%（v/v）的无醇啤酒。未发生突变的酵母可酿制低醇啤酒,但酒精浓度稍高（大部分为0.57%～0.84%,lip5突变株为1.64%）。有机酸（柠檬酸、延胡索酸和苹果酸）大幅增加弥补了酒精含量低带来的风味缺陷。另外,一些突变株释放高水平的乳酸（144（fum1）,622（kgd1）和495（kgd2）mg/L）。乳酸可使啤酒免受污染,并可掩盖不受欢迎的麦汁味。

有机溶剂二次沉淀法提取纯化酵母菌超氧化物歧化酶的研究

酿酒酵母BUV094经发酵培养后,离心收集菌体,将菌体用甲苯法破壁得到粗酶液,粗酶液经调节PH除杂蛋白,丙酮二次沉淀三步纯化工艺,得到纯化的SOD,其比活为1015U/mg,收率为65.2%。PAGE电泳后的活性染色显示,酵母超氧化物歧化酶具四条同功酶。该样品经K C N,H2O2,氯仿—乙醇抑制试验,酶类型为Cu/ZnSOD。

甜酒酿中酵母菌多样性的研究

从福建酒曲、苏州酒曲和安琪酒曲中分离出6株酵母菌。通过对所分离的酵母菌的18S rDNA进行分析鉴定,同时利用形态、生理生化的分析,最终确定这6株菌属于二个类群,其分别属于酿酒酵母属,复膜酵母属。利用18S rDNA的序列,进行聚类分析,这6株酵母菌其中福建酒曲中有4株酵母菌,分别为FJ-2、FJ-5、FJ-6、FJ-7,其中FJ-2与Saccharomyces cerevisiae strain OC11的相似性达到99%、FJ-5与S.cerevisiae S288c相似性达99%、FJ-6与S.cerevisiae strain OC11相似性达99%,FJ-7与Saccharomycopsis fibuligera strainYW12相似度达到99%。苏州酒曲中有1株,为SZ-2与S.cerevisiae的相似性达99%。安琪酒曲中有1株,该菌株与酿酒酵母的相似度为100%。由此可见,在酒酿中发挥作用的酵母菌是酿酒酵母属和复膜酵母属中的菌株。

一株高产2-苯乙醇酵母菌的筛选及鉴定

从24株不同来源的酵母菌中分离筛选出一株对2-苯乙醇耐受性强、生物转化合成2-苯乙醇能力高的优良菌株SH003,该菌株能在含有4 g/L的2-苯乙醇培养基中生长,在优化的转化条件下,转化合成2-苯乙醇质量浓度达4.31 g/L,生成速率为0.18 g/(L·h),L-苯丙氨酸摩尔转化率为72.4%,经菌落特征、菌体形态分析、生理生化试验,结合18S r DNA序列分析,由系统发育树表明它与酿酒酵母亲缘关系最近,确定该菌株为Saccharomyces cerevisiae。

湖南民间酒酿中酵母菌多样性的研究

从湖南民间收集的3种酒曲中共分离得到9株酵母菌株。利用26S rDNA的D1/D2区序列分析并结合形态学生理学特征对这些菌株进行鉴定,确定它们分别属于克鲁维毕赤酵母属和酿酒酵母属。其中4株属于克鲁维毕赤酵母属,5株属于酿酒酵母属。