酿酒酵母RAVE复合物的155kD亚基Rav1p的克隆及其在大肠杆菌中的表达纯化

以酿酒酵母基因组DNA为模板，根据GenBank上公布的酿酒酵母Rav1p基因（ray1）序列和表达载体特性设计特异性引物，PCR扩增得到4074bp的DNA片段，将PCR产物和原核表达载体pET28a（＋）同时进行双酶切；双酶切后的PCR产物和表达载体进行连接，构建成重组质粒pET28a．rav1。再将pET28a．rav1转化到BL21（DE3）感受态细胞中。经IPTG16℃低温诱导40h表达His-tag融合的Rav1p。诱导后的菌体进行超声波破碎，然后用GEheahhcare公司的AKTA蛋白纯化仪和HisTrapHP1mL亲和层析柱纯化目的蛋白。SDS—PAGE电泳分析和Westernblot分析显示在155kD有明显的条带，成功实现了Rav1p在大肠杆菌中的表达纯化。