广藿香醇合酶PcPTS互作蛋白的筛选与鉴定分析

【目的】广藿香[Pogostemon cablin(Blanco)Benth.]是临床常用的芳香化湿药,其质量指标成分广藿香醇具有良好的抗病毒、抗炎症等活性。广藿香醇合酶(Patchouli alcohol synthase,PcPTS)在广藿香醇生物合成途径中起关键作用,但其在蛋白互作层面调控广藿香醇合成的机制尚不清楚。旨在筛选PcPTS的互作蛋白,以揭示PcPTS在广藿香醇生物合成途径中的调控机制和功能。【方法】利用酵母双杂交技术和GST pull-down联合液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)技术筛选可能与PcPTS互作的蛋白,利用MASCOT软件和BLAST分析注释互作蛋白,选取有文献报道参与其他蛋白互作、影响蛋白转运、修饰或降解、参与次生代谢调控的蛋白,利用酵母双杂交技术初步验证它们与PcPTS蛋白的互作关系并对互作蛋白进行生物信息学分析。【结果】通过PCR技术成功克隆了PcPTS的cDNA序列,开放阅读框(ORF)为1659 bp,编码522个氨基酸。构建了广藿香cDNA初级文库和酵母杂交文库,初级和次级文库容量分别为7.6×10^(6) CFU和8.6×10^(6) CFU,初级和次级文库的重组率均为100%,且插入片段平均长度均大于800 bp。构建的诱饵载体pGBKT7-PcPTS对酵母菌株不产生毒性,且无自激活活性。利用酵母双杂交筛选得到阳性克隆并进行测序和BLAST分析,获得17个候选蛋白。成功构建了GST-PcPTS表达载体,诱导表达纯化获得GST-PcPTS诱饵蛋白,利用诱饵蛋白从广藿香总蛋白中捕获互作蛋白,共鉴定出98个候选互作蛋白。从候选蛋白中筛选14个可能与PcPTS互作的蛋白,利用酵母双杂交进行点对点验证,结果发现PcC3H6、PcENO3、PcACR11和PcHAD与PcPTS存在相互作用。生物信息分析表明,四者分别属于CCCH锌指蛋白家族、烯醇化酶蛋白、ACR亚家族和HAD-like超家族。【结论】初步筛选验证获得与PcPTS存在相互作用的4个蛋白PcC3H6、PcENO3、PcACR11和PcHAD,有助于揭示PcPTS在广藿香醇生物合成途径中的作用机制,也为进一步研究广藿香醇的合成调控机制奠定了坚实基础。

白藜芦醇合酶的研究进展

白藜芦醇是一种重要的植物抗毒素 ,具有多种医疗保健作用 ,因此其应用前景非常广泛 ,已引起多方关注。白藜芦醇合酶是白藜芦醇生物合成途径中的关键酶之一 ,它催化 1分子 4_香豆酰辅酶A和 3分子丙二酰辅酶A反应合成白藜芦醇 ,它是白藜芦醇生物合成中惟一必需的酶 ,关于它的研究已广泛开展起来。本文综述了白藜芦醇的药理活性、白藜芦醇合酶的酶学性质。

引物悬挂延伸PCR扩增白藜芦醇合酶cDNA

为了得到葡萄白藜芦醇合酶 RS 基因的 c DNA,实验以葡萄叶片为材料 ,利用引物悬挂延伸 PCR法 ,以葡萄总 DNA为模板 ,先分别扩增得到编码白藜芦醇合酶的第一外显子和第二外显子的序列 ,再以这两个序列为模板 ,进行第二轮的 PCR,得到大小与 RS基因大小相同的片段 ,经 PCR产物测序证明 ,两个外显子已经准确无误地拼接 ,此片段就是 RS基因 .

花生白藜芦醇合酶基因的DNA克隆及序列分析

白藜芦醇合酶(resveratrol synthase,RS)是合成白藜芦醇的关键酶.通过PCR方法从花生基因组DNA中分离出白藜芦醇合酶基因,将其克隆到pMD18-T和pBluescript Ⅱ KS(+)载体并测序,获得全长1 537 bp的片段.序列分析表明,此序列含有2个外显子和1个内含子,编码区由389个氨基酸组成,其相对分子质量为42 800.该白藜芦醇合酶氨基酸368～378位点上存在芪合酶家族的特征位点GVLFGFGPGLT.

虎杖白藜芦醇合酶基因转化拟南芥的研究

为验证虎杖白藜芦醇合酶基因PcRS在转基因植物中合成白藜芦醇的有效性,构建了植物表达载体pCAM1380-35S-PcRS,通过农杆菌介导,利用花序浸泡法转化拟南芥.转化子在含有潮霉素的培养基上经筛选后,利用PCR和Southern杂交技术检测,进一步证实PcRS基因已整合到拟南芥基因组.经过选育得到了遗传稳定的T3代纯合子转基因拟南芥株系.Northern杂交证实外源基因在转基因拟南芥纯合子株系中实现表达,并且通过HPLC法检测到终产物是反式白藜芦醇苷.两周大拟南芥幼苗产生的反式白藜芦醇苷为136μg/g(鲜重),干重为1813μg/g.

丹参环阿屯醇合酶基因克隆及表达分析

以丹参cDNA为模板,克隆了丹参环阿屯醇合酶(cycloartenol synthase,CAS)基因的cDNA序列(SmCAS),对其序列进行生物信息学分析,并采用实时荧光定量PCR方法研究了该基因在丹参不同器官及不同胁迫处理下的表达模式。结果显示:该基因全长2 346bp,包含2 271bp开放阅读框,编码756个氨基酸。预测其编码蛋白分子量为86.16kD,具有氧化鲨烯环化酶超家族典型的DCTAE结构域和QW结构域。该基因推测的氨基酸序列与人参、田七、积雪草、甘草、拟南芥的相似性分别为83%、84%、83%、81%和80%。SmCAS基因在丹参根、茎、叶、花中均有表达,在花中表达量最高;而且SmCAS基因能够响应ABA、低温和干旱的诱导。

盾叶薯蓣环阿屯醇合酶基因克隆与表达(英文)

利用巢式PCR和RACE技术从盾叶薯蓣中克隆了阿屯醇合酶的cDNA(定名为DZCAS).结果表明,该cDNA的开放读码框为2280bp,编码759个氨基酸的多肽,分子量为86924Da,等电点为6.39.氨基酸序列比对表明盾叶薯蓣阿屯醇合酶与其他植物阿屯醇合酶的相似性超过70%,含有环阿屯醇合酶共有的保守序列.利用氧化鲨烯环化酶基因缺陷型酵母表达DZCAS,并用高效液相色谱和液质联用仪检测酵母细胞中环阿屯醇合成情况,证明DZCAS编码环阿屯醇合酶.RT-PCR分析表明,DZCAS在盾叶薯蓣幼叶中表达量最高,其次是在地下幼嫩块茎中,而地上幼茎表达量最低.

白藜芦醇合酶基因的克隆及对毕赤酵母的转化

目的建立白藜芦醇合酶基因的毕赤酵母表达系统。方法通过PCR、限制性内切酶消化、连接、电激等方法,构建表达载体,转化毕赤酵母GS115。结果从葡萄基因组DNA中扩增得到了 1 200 bp目的基因,并克隆至pBS-T栽体;成功构建了表达载体pPIC3．5K／RS;目的基因成功整合进毕赤酵母GS115基因组中。测序及PCR鉴定证明,白藜芦醇合酶基因的毕赤酵母表达系统建立成功。结论所得方法无需高质量的RNA,从而降低了试验条件,达到了快速简便的目的。

白藜芦醇合酶基因的克隆与植物表达载体的构建

目的为获得含有白藜芦醇(Res)的转基因植物,进行了白藜芦醇合酶(RS)基因的克隆、植物表达载体构建的研究。方法以葡萄为材料,从其叶片中提取基因组DNA,并以此DNA为模板,利用PCR法扩增得到RS基因,将此基因连接到克隆载体PGEM-TVector,得到重组载体pT-RS;经酶切及测序鉴定后,将RS基因克隆到植物表达载体pBI121,得到重组载体pBI-RS,用PCR及酶切方法进行鉴定。结果重组质粒pT-RS的测序结果表明,RS基因的片段大小为1.522kb。将此片段正向插入植物表达载体pBI121的CaMV35s启动子和NOS终止子之间,对重组子进行PCR及酶切鉴定,均得到预期大小的片断,证明RSDNA与质粒pBI121已成功连接,植物表达载体pBI-RS构建正确。结论成功扩增得到RS基因及成功构植物表达载体pBI-RS,为RS转基因生菜的研究奠定了基础。

醇用量及种类对聚烯烃用MgCl_2醇合物载体制备的影响

为了制备可负载烯烃催化剂的球形载体,根据沉淀析出原理,分别利用乙醇、正丁醇、正己醇、正辛醇和异辛醇制备了多种MgCl_2载体.利用X射线衍射仪、红外光谱仪和扫描电子显微镜对载体的晶型和形貌进行了分析,研究了醇用量和种类对载体制备的影响.结果表明,该方法能够制得晶体高度无序的球形载体,且载体形态和粒径与醇种类和用量密切相关.当单独采用正丁醇时,所得载体的平均表观粒径为11.98μm.异辛醇与正丁醇、乙醇配合可制得形态良好的载体,而正己醇和正辛醇则无法用于制备球形载体.

XRD表征氯化镁乙醇醇合物的结构

制备了一系列乙醇与MgCl2摩尔比（简称醇镁比）不同的MgCl2醇合物,采用XRD方法研究了MgCl2醇合物的晶体结构,并通过对晶胞参数的计算分析了MgCl2醇合物中结构稳定的组分.表征结果显示,醇镁比在1.5～6之间的MgCl2醇合物有4种结构稳定的组分,分别为MgCl2·6EtOH,MgCl2·3.33EtOH,MgCl2·2.8EtOH,MgCl2·1.5EtOH.不同醇镁比的MgCl2醇合物是由这4种结构稳定的组分中的一种或几种组成的.

花生白藜芦醇合酶基因cDNA的克隆及植物表达载体的构建

为得到含有白藜芦醇合酶cDNA(RS cDNA)并能表达白藜芦醇(Res)的转基因植物,以花生为材料,从其根部提取基因组DNA,并以其为模板,利用引物悬挂延伸PCR法扩增得到大小约1200bp的片段,将这个片段连接到克隆载体PBS-T上进行测序,测序结果证明,此片段就是花生的RS cDNA。将此片段再正向插入到植物表达载体PBI121的CaMV35s启动子和NOS终止子之间,对重组子进行筛选与鉴定,证明花生的RS cDNA已经正确插入PBI121中,成功的构建了植物表达载体PBI121L。

葡萄白藜芦醇合酶基因cDNA克隆及原核表达

从贝达葡萄中提取总RNA,采用RT-PCR方法,克隆到了白藜芦醇合酶(resveratrol synthase,RS)基因的全长cDNA。将其与圆叶葡萄(Vitis rotundifolia)、华东葡萄(Vitis pseudoreticulata)、河南毛葡萄(Vitis ficifolia)、河岸葡萄(Vitis vulpine)、酿酒葡萄(Vitis virufera)、羊蹄甲(Bauhinia)、花生(Arachis hvpogaea)、虎杖(Polygonum cuspiaatum)、大黄(Rheum officinale)进行氨基酸同源性比对,结果表明:分离的RS基因与其他葡萄的RS基因编码的氨基酸同源性达到97%以上,与其他属的RS基因编码的氨基酸同源性达到64%以上。生物信息学分析表明,该蛋白分子量为43kD,等电点pI=6.2,包含392个氨基酸残基。将RS的全长cDNA插入到表达载体pET28a中构建重组表达质粒pET28a-RS,转化大肠杆菌BL21,SDS-PAGE电泳检测结果表明,以30℃、0.5mmol.L-1IPTG诱导4h时该基因表达效果最好,诱导产物为1个约43kD的蛋白,为进一步纯化和鉴定目的蛋白提供了基础。

CaCl_2·2CH_3OH醇合反应动力学研究

建立了一套简单的储能醇合反应的实验装置，并利用该装置研究了该反应动力学的某些问题．探讨了反应温度条件、反应循环次数、固体颗粒大小、反应床层厚度、温度和压力等对醇合反应速率的影响，提出了宏观反应的两段模型假定．

花生白藜芦醇合酶基因的克隆与生物信息学分析

利用Protparam、iPSORT prediction、ProtScale、SOPMA、Swiss-Modeling和Scan Prosite等生物信息学工具分别对其理化性质、信号肽、疏水性、亲水性、二级结构和三级结构进行分析。以花生粤油45总DNA和总RNA为模板,采用PCR和RT-PCR技术克隆花生白藜芦醇合酶基因的DNA和cDNA序列,并利用SWISS-PROT、DNAMAN等生物信息学工具对其基因和蛋白质序列进行了分析。测序结果显示,该基因的DNA和cDNA序列长度分别为1 498 bp和1 251 bp,cDNA序列具有完整的开放性阅读框,编码389个氨基酸的多肽。该白藜芦醇合酶氨基酸368-378位点上存在芪合酶家族的特征位点GVLFGFGPGLT。同源性分析表明,其碱基序列与已报道的花生白藜芦醇合酶基因的一致性为99%,其氨基酸序列与已报道的花生白藜芦醇合酶氨基酸序列的一致性为100%。

农杆菌介导白藜芦醇合酶基因转化蔓茎堇菜的研究

目的:通过农杆菌介导法将白藜芦醇合酶基因转化蔓茎堇菜,并对转化条件进行优化。方法:以蔓茎堇菜叶柄为受体材料,采用叶盘法进行遗传转化,实验过程中对影响转化的一些主要因素进行筛选研究。结果:最佳的侵染条件为OD6000.3的菌液侵染10min,头孢霉素的适宜浓度为250mg/L。转化后的蔓茎堇菜外植体经3.0mg/L潮霉素筛选,最终得到9株抗性再生苗,转化频率为0.98%。结论:该研究为建立一个农杆菌介导白藜芦醇合酶基因转化蔓茎堇菜的遗传体系提供了基础。

差示扫描量热法表征氯化镁乙醇醇合物结构

采用差示扫描量热法（DSC）研究了EtOH/MgCl2的摩尔比在1.5～2.8的氯化镁乙醇醇合物的结构。研究表明,该区间的氯化镁乙醇醇合物存在两种稳定的组分,经推断这两种组分分别是MgCl2·2.8EtOH和MgCl2·1.5EtOH,它们的熔融峰值分别在115℃和155℃附近,该区间的氯化镁醇合物是由这两种稳定的组分组成的混合物。另外,氯化镁醇合物的熔点对水分很敏感,微量的水分会使醇合物的熔点降低。热分析结果显示,在MgCl2·2.8EtOH醇合物中存在微量的水分时会在100℃形成特征峰。对具有微量水分且EtOH/MgCl2的摩尔比在1.55～2.64的氯化镁醇合物进行减压脱醇时,首先减少的是MgCl2·2.8EtOH组分,其次是MgCl2·2.8EtOH与微量水分形成的组分,并且没有水分被脱除掉。

蛇白蔹白藜芦醇合酶基因CNRS2的克隆与原核表达

白藜芦醇合酶(resveratrol synthetic enzyme,RS)是植物白藜芦醇合成途径中的关键酶,利用已知的葡萄RS基因(AF274281)序列设计并合成了一对引物,以蛇白蔹基因组DNA为模板,PCR扩增得到包含RS完整基因在内的一段序列,测序与序列分析表明:该克隆片段全长1 536bp,其中包含一个内含子及两个外显子。采用悬挂延伸PCR法克隆了目的基因,命名为CNRS2。序列分析表明该基因的开放读码框1 170 bp,编码389个氨基酸残基。同源性比较发现,CNRS2与已知葡萄RS基因序列的同源性达93%～98%。CNRS2与pET-30a(+)构建原核表达载体,经IPTG诱导后可表达获得相对分子量约为46 kD的外源融合蛋白。以上结果证实CNRS2属葡萄RS基因家族成员,为今后进一步对该基因的研究利用打下基础。

赤霞珠白藜芦醇合酶基因的克隆及酿酒酵母表达载体的构建

为克隆酿酒葡萄品种赤霞珠的白藜芦醇合酶基因并构建其酿酒酵母表达载体,利用改良CTAB法提取赤霞珠葡萄叶片组织中的DNA,根据文献报道的序列(Genbank登录号AF128861)设计引物扩增得到白藜芦醇合酶基因全长序列。将全长序列克隆至克隆载体后,通过重叠延伸PCR扩增到RS基因cDNA片段。然后分别将RS基因全序列和cDNA片段连接至真核表达载体pGBKT7,经克隆和测序分析后,构建两种真核表达载体pGBKT7/RSDNA和pGBKT7/RScDNA,用SD-trp选择培养基筛选出阳性克隆,菌落PCR验证得到阳性转化子。

白藜芦醇合酶基因表达载体构建及对马铃薯的遗传转化

利用从葡萄中克隆到的白藜芦醇合酶基因(Resveratrol Synthase,简称RS)构建了含有35S组成型启动子的植物表达载体P35s-2300-RS,应用农杆菌介导方法对马铃薯品种进行遗传转化。通过对抗性芽、生根、再生植株的筛选,得到5株再生小苗。经PCR、Southern检测证实,有3株为真正的转基因植株。