毕赤酵母醇氧化酶1启动子突变体的分离与鉴定

目的:通过醇氧化酶1启动子突变,筛选毕赤酵母高水平表达菌株。方法:通过致错PCR构建醇氧化酶1启动子突变体,经酶切连接到改造过的质粒HSA-pPIC9上,转化毕赤酵母GS115感受态细胞,摇瓶培养表达筛选人血清白蛋白(HSA)高表达突变体菌株。结果:克隆测序结果表明,突变的醇氧化酶1启动子-910和-569位点处共2个碱基发生了T→C突变;获得一株高表达菌株,摇瓶中HSA的表达量由200 mg/L提高到335 mg/L。结论:通过醇氧化酶1启动子突变成功构建了HSA高表达菌株。

毕赤酵母醇氧化酶2启动子上游调控序列的随机突变研究

巴斯德毕赤酵母是表达外源蛋白的重要宿主之一。醇氧化酶2启动子(P_(AOX2))与醇氧化酶1启动子(PAOX1)的启动模式相同,但是启动强度不同。为了研究其醇氧化酶启动子P_(AOX2)的上游调控序列,本文利用随机突变的方法对醇氧化酶启动子P_(AOX2)的上游调控序列进行了随机突变,构建了P_(AOX2)上游调控序列突变文库,检测突变体启动子的启动能力。结果表明P_(AOX2)的-788位置插入碱基T可导致表达能力降至36%,在P_(AOX2)的-847位置插入碱基A可导致表达能力降至10%,说明这两个位置对P_(AOX2)的启动能力有重要作用。本研究为阐明P_(AOX2)上游调控序列的作用提供了帮助。

微生物酶制剂中转基因微生物的实时荧光PCR检测方法

针对微生物酶制剂中残留转基因微生物的检测问题,根据醇氧化酶-1(AOX1)启动子基因的序列信息设计一对引物及一条MGB探针,建立了转基因微生物的实时荧光PCR筛选检测方法。实验结果表明,该方法灵敏度达到1pg,可以准确判定生产线上不同分离阶段的微生物酶制剂中的转基因微生物残留情况。该方法准确度和灵敏度高,操作方便,可作为微生物酶制剂中转基因微生物分离状况的监测方法,也可为其他转基因微生物检测研究提供借鉴和参考。

大鼠羧肽酶原B在毕赤酵母中的表达与培养条件优化

目的:利用毕赤酵母表达系统,表达大鼠羧肽酶原B(procarboxypeptidaseB,proCPB)蛋白,同时探讨最优表达条件,为规模化发酵生产羧肽酶B奠定基础。方法:以RTPCR法从SD大鼠胰腺细胞中克隆了proCPB基因,将其插入pPIC9载体,转入毕赤酵母Gs115细胞,在甲醇的诱导下表达目的蛋白。结果与结论:首次实现了proCPB在毕赤酵母中的成功表达;通过表达条件的优化,使用BMGY(pH6.0)培养基,添加0.5%(体积比体积)的酪蛋白水解物和3mmol/L的PMSF,于28℃,每隔12h补加0.5%(体积比体积)的甲醇,重组酵母Gs115proCPB表达的重组蛋白可达500mg/L,表达的目的蛋白占总蛋白的94%,活化后的重组CPB相对分子质量为35.1×103,与理论值(35.2×103)极相近。活性测定表明,重组proCPB活化后的CPB的比活力可达110U/mg(CPB参照品为180U/mg)。