薰衣草醇酰基转移酶基因(AAT)的克隆和表达分析

醇酰基转移酶(AAT)可以催化乙酰辅酶A与萜烯醇类物质的结合,生成各类乙酸酯类化合物。为探明薰衣草AAT基因在酯类化合物合成中的调控作用,本研究以薰衣草品系杂花叶片为供试材料,利用反转录PCR技术克隆薰衣草AAT基因的cDNA序列,该cDNA序列长度为1344 bp,其编码蛋白质由447个氨基酸组成,是非跨膜亲水性蛋白质,属于PLN02481超级家族;薰衣草AAT与黄色猴面花EgAAT亲缘关系最近,相似度为60.87%。AAT基因在苞叶中的表达量最低,在花瓣中的表达量最高;在花冠不同发育时期,该基因在盛开期表达量到达峰值。构建原核表达载体pET-28a-AAT,筛选了重组蛋白在大肠杆菌Transetta(DE3)中的最适诱导表达条件,诱导后获得的重组蛋白质相对分子质量为5.026×10^(4),重组蛋白以包涵体形式存在,具有将芳樟醇催化合成乙酸芳樟酯的生物活性。本研究结果为进一步验证薰衣草AAT基因在酯类化合物合成过程中的功能提供了基础。

草莓果实发育过程中芳香物质含量和醇酰基转移酶活性的变化

以‘丰香’和‘罗莎’两个风味品质差异显著的草莓品种为试材,采用气谱—质谱联用技术测定果实中芳香物质的成分及相对含量,同时采用DTNB比色法测定果实中醇酰基转移酶活性。结果表明:‘丰香’成熟果实中的芳香物质以酯类(32.18%)、醛类(19.55%)和酮类(16.82%)化合物为主;‘罗莎’成熟果实中的芳香物质以醛类(41.51%)和酯类(23.25%)化合物为主。随果实发育,‘丰香’和‘罗莎’果实中酯类和酮类化合物的相对含量呈上升趋势,而醇类和醛类化合物则呈下降趋势。‘丰香’果实红熟期酯类化合物的相对含量是粉熟期的4倍,醇类化合物则由粉熟期的54.35%降至5.17%。随着果实发育,‘丰香’和‘罗莎’中AAT酶活性显著升高,‘丰香’果实各发育期的AAT酶活性显著高于‘罗莎’。

番茄醇酰基转移酶基因SlAAT1克隆、序列分析和原核表达

酯类物质是许多果实香气的主要成分。醇酰基转移酶(AATs)是酯类化合物合成的关键酶。本研究通过反转录PCR,从番茄的成熟果实中克隆了SlAAT1基因(GenBank登录号为JQ070977),其编码一个含有442个氨基酸残基的蛋白,含有醇酰转移酶BAHD家族的H-x-x-x-D和DFGWG保守基序。系统进化分析表明,SlAAT1与苹果MpAAT1,山字草的BEBT及烟草Hsr201等聚在同一分支,进化关系较近。SDS-PAGE电泳分析表明,转化SlAAT1基因的大肠杆菌BL21(DE3)在22℃、0.8 mmol.L-1IPTG条件下可获得大量的可溶性目标蛋白。同时,纯化的SlAAT1大肠杆菌重组蛋白的体外酶活性分析表明了SlAAT1重组蛋白具有醇酰基转移酶活性,可能参与了酯类挥发性成分的合成。

桂花花瓣醇酰基转移酶基因的克隆与表达

为探讨桂花花瓣醇酰基转移酶基因的功能,从桂花品种‘柳叶金桂’花瓣中克隆得到1个醇酰基转移酶基因,命名为OfAAT1,该基因全长1 386bp,编码461个氨基酸;通过qRT-PCR分析发现,OfAAT1基因在花器官尤其在花瓣中大量表达,而在幼叶中基本不表达;其表达量随着花朵的开放逐渐增加,至盛花期达到最大,末花期又减少;OfAAT1基因的表达量在盛花期还呈现明显的昼升夜降的节律性变化;进一步的氨基酸序列比对和系统进化树分析表明,该基因编码的氨基酸存在酰基转移酶BAHD家族特有的保守结构域,与矮牵牛PhCFAT亲缘最近,其次是大豆GmCHAT和马铃薯StCHAT;结合桂花花瓣香气挥发性成分分析,初步推测桂花OfAAT1的功能可能与矮牵牛PhCFAT相似,可催化松柏醇产生松柏二酯,进一步被降解为异丁香酚,或与大豆GmCHAT和马铃薯StCHAT相似,与以脂肪酸为底物的酯类香气合成相关。

醇酰基转移酶催化合成白酒中的乙酸乙酯研究进展

乙酸乙酯是白酒中最重要的一类活性风味物质,其含量影响白酒的品质和香型。鉴于乙酸乙酯对白酒风格的重要性,研究其在白酒酿造过程中的形成机理具有重要的意义。白酒中乙酸乙酯主要来源于生物合成途径,而产香酵母是酿造过程中重要的乙酸乙酯产生菌株。对于白酒酿造过程,本文重点论述对白酒酯类形成起最重要作用的“酯化酶”之一--醇酰基转移酶在酵母催化合成乙酸乙酯中的研究现状,并对其研究前景进行展望。

葡萄醇酰基转移酶编码基因遗传变异研究

【目的】开发适用于葡萄香气表型鉴定的分子标记,为葡萄分子辅助育种提供理论依据。【方法】采用固相微萃取结合气相质谱法对45个葡萄品种进行香气组分和含量测定,并分别采用Sanger测序和扩增子测序的方法对葡萄醇酰基转移酶编码基因(VvAAT)结构变异和SNP变异进行分析。【结果】45个葡萄品种中共发现65种香气组分,可以分成酯类、醇类、萜类和醛类4种类型,其中酯类香气含量表现出显著的品种差异性,‘巨峰’等20个葡萄品种酯类香气含量丰富,而‘87-1’等25个葡萄品种检测不到酯类香气;VvAAT共发现了5种结构变异类型,类型I、II、IV和V由于过早终止密码子或片段插入变异,不能正确翻译,仅类型III可以正常翻译,根据其氨基酸序列系统进化树分析结果,又可以分成III.1和III.2两种类型,结合香气测定数据,III.1为功能型,其余均为非功能型;扩增子测序及生信分析发现了8个位于外显子区域的SNP位点(T32C、A69T、G436C、A1247G、A1818T、G1929T、A1959G和C1975G),均导致了编码氨基酸的突变,可以准确区分酯香型品种和非酯香型品种,准确率为97.8%。【结论】葡萄VvAAT位点存在丰富的遗传变异,包括基因结构变异和SNP变异;位于编码区的8个SNP位点能够准确判定葡萄酯类香气表型,可以应用于葡萄分子辅助育种。

甜瓜果实醇酰基转移酶基因的克隆及表达分析

根据在GenBank中登录的烟草、番茄等的醇酰基转移酶基因的保守序列设计引物,利用RT-PCR和RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends,cDNA末端快速扩增)技术从甜瓜自交系M01-3花后25 d的果实总RNA中扩增到甜瓜醇酰基转移酶基因全长cDNA。该基因全长为1 429 bp,开放读码框为1 383 bp,编码461个氨基酸,GenBank中登录号为EU431334。利用荧光定量PCR方法进行了该基因在果实发育过程中的表达特性分析,结果表明该基因在花后15 d果实中的表达量最低,成熟果实中表达量最高。

β-葡萄糖苷酶和醇酰基转移酶对中国水仙花挥发性成分的影响

采用顶空固相微萃取(HS-SPME)-气相色谱/质谱(GC/MS)联用技术分析了中国水仙花主要挥发性成分芳樟醇、乙酸苯甲酯及乙酸苯乙酯的含量,并测定了醇酰基转移酶、β-葡萄糖苷酶的活性。伴随着花的发育,芳樟醇含量在花蕾期含量最高,然后逐渐下降;乙酸苯甲酯、乙酸苯乙酯含量呈先升高后降低的趋势,盛开期含量最高;β-葡萄糖苷酶活性在盛花期最高;醇酰基转移酶活性从花蕾期到盛花期变化不大,盛花期后明显下降。结果表明乙酸苯甲酯、乙酸苯乙酯的含量与β-葡萄糖苷酶、醇酰基转移酶有一定的相关性。

酿酒酵母醇酰基转移酶的研究进展

酵母发酵产生酯类化合物是白酒发酵过程中的重要产香成分之一。在白酒多年的发展过程中,其香味物质的成分一直不能为人们标准化,不能实现更好的机械化智能化的生产,因此研究酵母产酯途径已成为人们现在热议的话题。该文综述了酿酒酵母酰基酯合成途径中的关键酶的酶学性质、晶体结构与分子催化机制,并展望了其在提升白酒品质和推进白酒的标准化进程的潜力与价值。

中国梨醇-酰基转移酶基因的克隆及遗传多态性

以6个中国梨品种为实验材料,对基因组DNA进行醇-酰基转移酶(AAT)基因的特异性PCR扩增、克隆、DNA序列测定和生物信息学分析,研究了中国梨AAT基因的遗传多态性。结果表明,浓香、微香、无香梨品种中均克隆到约1 600 bp大小的1-4条AAT基因。其中外显子部分存在1个HXXXD活性区和4个可变区,内含子中至少存在8处长度缺失和突变。基因结构分析表明,这些AAT基因同属于家族cl03601的转移酶基因家族pfam02548。系统发育分析表明,本实验所克隆到的中国梨AAT基因关系最近,与网上已知序列的苹果和西洋梨的关系略远。

森林草莓醇酰基转移酶基因FvAATW2功能研究

在从森林草莓(Fragaria vesca L.)成熟果实中克隆到醇酰基转移酶基因(FvAATW2)的基础上,构建由CaMV35S启动子驱动的植物正义表达载体pBI121-FvAATW2,在烟草(Nicotiana tabacum L.)和草莓(Fragaria×ananassa Duch.)‘Camarosa’品种中过量表达FvAATW2,以研究其功能。采用农杆菌介导的叶盘法转化烟草和草莓;利用PCR和Southern blot筛选出转基因株系;通过实时定量PCR和测定AAT酶活性来检测转基因植株中外源基因的表达;利用SPME/GC–MS方法检测烟草叶片和草莓果实中的挥发性成分。对转基因烟草外源基因表达和早期叶片挥发性成分的检测结果表明,构建的FvAATW2表达载体功能正常,转基因株系能够在生长早期合成酯类物质;通过检测转基因草莓成熟果实的酯类成分发现,与野生型对照相比,转基因草莓果实中酯类占挥发物的总比例以及乙酸辛酯、己酸乙酯、己酸辛酯、辛酸乙酯等挥发酯的比例显著提高,而丁酸甲酯的含量显著降低,辛酸乙酯的含量显著增加,说明外源FvAATW2在草莓中能够正常表达并影响果实酯类合成,从而通过改变挥发性酯类构成使果实香气变浓。

法尔皮有孢汉生酵母(Hanseniaspora valbyensis)醇乙酰基转移酶的分离纯化及特性

乙酸苯乙酯是苹果酒里的重要香气物质之一,是在醇乙酰基转移酶(AATase)的催化下由乙酰辅酶A和苯乙醇缩合而成。从法尔皮有孢汉生酵母(Hanseniasporavalbyensis)中收集细胞膜片段,然后经过DEAESepharose、SephadexG-75、OctylSepharose三步层析分离得到纯酶。纯化后的酶经SDS-PAGE电泳,得到一条明显的条带,分子量在37kD左右。此酶的最适反应条件是在30℃、pH7.0,在10℃以下酶比较稳定,pH稳定在7.0～8.0。重金属离子Hg2+、Zn2+、Pb2+对酶活有明显的抑制,EDTA、Mn2+对酶活没有太大的影响,Mg2+能激活此酶。此酶也能催化其它重要乙酸酯的合成,但对乙酸苯乙酯的合成具有特异性。

嫁接对薄皮甜瓜果皮和果肉中主要酯类、游离氨基酸及酯类合成相关酶活性的影响

目的研究嫁接对薄皮甜瓜不同发育时期果皮和果肉中主要酯类、氨基酸以及相关酶活性的影响,以期明确嫁接对薄皮甜瓜果实中芳香物质影响的初步机制,并阐明氨基酸与酯类物质形成的关系。方法利用固相微萃取法(SPME)和气相色谱法(GC)结合定量检测4种主要挥发性酯类物质含量,测定游离氨基酸的种类和含量及酯类合成关键酶醇脱氢酶(ADH)和醇酰基转移酶(AAT)活性。结果嫁接提高了果皮和果肉中乙酸乙酯含量,降低了乙酸己酯和乙酸苯甲酯含量;提高了果皮中乙酸-2-甲基-1-丁酯含量,但降低了其在果肉中含量。共检测到16种游离氨基酸,氨基酸含量随着果实成熟逐渐升高,且嫁接果实氨基酸含量在前期高于自根,而在发育中后期低于自根,并验证了缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸参与了乙酸-2-甲基-1-丁酯的合成。嫁接极显著地降低了果皮中ADH和AAT活性,显著降低了果肉中AAT和ADH活性。结论嫁接改变了甜瓜果皮和果肉中主要酯类含量,成熟期果皮中酯类含量高于果肉。嫁接使大部分游离氨基酸含量降低,其中部分氨基酸参与了支链酯类的合成。嫁接总体上降低了ADH和AAT活性。

1-甲基环丙烯处理(1-MCP)对南果梨酯类物质、氨基酸及相关代谢酶的影响

以南果梨为材料,研究1-MCP处理对南果梨酯类物质、氨基酸含量及其代谢相关酶:醇脱氢酶(ADH)、醇酰基转移酶(AAT)和丙酮酸脱羧酶(PDC)活性变化的影响。结果表明:经1-MCP处理的果实酯类物质相对含量高峰值出现的时间延后15d,而且酯类物质的种类较对照果实减少了27.3%;处理的果实中15种游离氨基酸总量明显降低;1-MCP处理对果实AAT酶和PDC酶活性有明显的抑制作用,而对ADH酶活性的影响不明显。由此可见,1-MCP处理影响以氨基酸为前体物合成酯类物质的正常代谢过程,从而使南果梨在采后后熟过程中特有的香气变淡。

草莓果实酯类合成关键酶基因SAATB2和VAATW2表达特性分析

利用RT-PCR的方法,分别从凤梨草莓栽培品种‘红颜’和森林草莓白果类型的成熟果实中克隆酯类合成关键酶基因SAATB2和VAATW2。利用半定量RT-PCR和酶活性测定分别对SAATB2、VAATW2在不同组织和花后不同发育时间果实中的表达情况进行分析。结果发现,SAATB2主要在果实中表达,而VAATW2则在叶片和果实中都有表达,说明AAT在草莓组织中的表达特性存在种间差异。而SAATB2和VAATW2在果实发育期间具有相同的表达趋势,表达量随果实发育先升高后降低,最大表达量均出现在完全成熟前后,但达到最大值的时间略有不同。‘红颜’和森林草莓的果实挥发性酯类质量分数随果实发育升高,完全成熟时达到最大质量分数,与AAT基因表达量的变化基本一致。

乙烯利对1-MCP处理南果梨冷藏后香气及香气合成过程中关键酶活的影响

以南果梨为试材,研究冷藏(0±0.5)℃5个月后常温货架期间脂肪酸代谢途径关键酶脂氧合酶(LOX)、氢过氧化物裂解酶(HPL)、醇脱氢酶(ADH)、醇酰基转移酶(AAT)活性的变化,探讨外源乙烯对南果梨香气代谢的作用机理,为1-MCP和外源乙烯应用于南果梨贮藏保鲜提供理论依据。南果梨采收当天用0.75μL/L的1-MCP保鲜剂处理24h,在常温条件下放置7d后冷藏5个月,出库后分别用2、4、6、8mmol/L乙烯利处理2min。结果表明:除2mmol/L外源乙烯处理的乙酸庚酯和庚酸乙酯的相对含量低于对照组外,2mmol/L外源乙烯处理的乙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、乙酸己酯和苯乙酸乙酯的相对含量均明显高于对照和其他几种处理。2mmol/L外源乙烯处理的LOX、HPL和AAT活性始终高于对照和其他几种外源乙烯的处理;不同浓度的外源乙烯对ADH酶活性的影响作用不明显,对照和不同浓度乙烯利处理的ADH酶活性值相差不多。由此可知,2mmol/L外源乙烯处理效果最好,可以提高LOX、HPL和AAT的酶活性,从而更有利于提高南果梨果实冷藏后货架期间的香气品质。

紫果西番莲果实发育过程中挥发性香气物质及相关酶活性的变化

以西番莲香气物质较丰富的紫果‘台农1号’为试材,选取未成熟(T_(1))、近成熟(T_(2))和完全成熟(T_(3))3个时期果实,采用顶空–固相微萃取–气质联用(HS-SPME-GC-MS)技术测定3个果实发育过程的挥发性香气物质组成及含量变化情况,同时检测对应果实中酯类香气物质合成相关的脂氧合酶(LOX)和醇酰基转移酶(AAT)活性,以期了解不同发育时期果实主要致香物质变化情况及物质与相关酶活性之间的相关性。结果表明:随着西番莲果实成熟度的增加,挥发性香气物质的种类和含量均有很大的提高,3个时期检测的香气物质总数分别为72种、95种和136种,总峰面积呈倍数增加;未成熟(T_(1))和近成熟(T_(2))2个时期萜烯类和酯类物质为主要的挥发性香气物质,在完全成熟(T_(3))时期主要的挥发性香气为酯类,其峰面积占总峰面积达80.31%;随着果实成熟度的增加,酯类香气的种类和含量不断的提升,其中己酸乙酯,1-甲基己酯-己酸、丁酸乙酯、辛酸乙酯、1-甲基辛酯-丁酸、己酸己酯、1-甲基己酯-丁酸、丁酸己酯、(Z)-3-己烯基酯-己酸、乙酸己酯、2-甲基-辛酯-丙酸、辛酸己酯、3-羟基乙酯-己酸、(Z)-2-丁酸-乙酯等含量提升或占比较大,这些脂肪酸代谢途径产生的酯类在西番莲果实成熟过程中可能发挥了致香作用。LOX是酯类合成第一步的限速酶,AAT为酯类合成最后的关键酶。对不同发育期果实酯类合成相关酶活性测定结果表明,随着果实成熟度的增加,LOX、AAT酶活性呈上升趋势,尤其是T_(3)时期AAT酶活性显著的提升。由此推断,紫果西番莲果实发育过程中LOX和AAT酶的活性与酯类香气成分形成直接相关,酶活性的提升促进酯类香气的合成。

荜拨油非皂化物对小鼠胆固醇代谢的影响

荜拨油非皂化物(OPUM)40mg/kg,灌胃给药20d,显著降低喂饲含2%胆固醇饲料诱发的外源性高胆固醇血症小鼠TC、(LDL+VLDL)-c及肝脏胆固醇,并明显增加胆汁胆固醇。OPUM20、30和40mg/kg,降TC作用随剂量增加而增强。OPUM 40mg/kg,显著提高ip蛋黄乳液的小鼠血清卵磷脂胆固醇酰基转移酶(LCAT)活性。提示OPUM有降低血脂从而抑制As的形成和发展的作用,这与其促进胆固醇酯化及排泄有关。

超高压对西瓜汁香气相关酶的活性影响研究

超高压处理是一种非热加工技术,对食品加工与贮藏有重要意义。本文旨在研究超高压技术对西瓜汁风味物质相关酶活的影响,确定在贮藏过程中保持西瓜汁香气品质的最佳参数。利用紫外分光光度法测定了超高压处理后的西瓜汁在4℃下贮藏10 d,脂氧合酶(LOX)、氢过氧化物裂解酶(HPL)、醇酰基转移酶(AAT)活性的变化。将西瓜汁在400 MPa超高压下处理20 min后,利用气相色谱串联质谱,分析10 d内风味物质的变化。结果表明,超高压对这三种酶均会产生一定的钝化效果,在1~2 d酶活性基本达到最大值,2 d后,酶活性随贮藏天数的增加而逐渐降低,相同的压力条件下,保压时间越久酶活性越低。最佳参数为压力400 MPa,保压时间20 min,在此条件下贮藏期1~10 d,西瓜汁中典型风味物质均不发生明显变化。该技术为西瓜汁的贮藏与加工提供了一定的理论依据。

菠萝蜜果实成熟过程中香气物质形成相关酶的活性变化

[目的]分析菠萝蜜果实成熟过程中香气物质形成相关酶的活性变化,确定对菠萝蜜果实香气物质形成起关键性作用的酶,为菠萝蜜栽培及育种提供理论支撑。[方法]以不同基因型的菠萝蜜为材料,分别以亚油酸钠、氢过氧化亚油酸钠、乙醛和丁醇为底物,测定脂氧合酶(LOX)、氢过氧化物裂解酶(HPL)、醇脱氢酶(ADH)和醇酰基转移酶(AAT)在果实成熟过程中的活性变化。[结果]在果实成熟过程中,LOX在果实成熟早期具有较高活性,在香气物质合成的前期起主要作用;HPL主要参与菠萝蜜果实中醛类香气的形成;ADH活性水平较高;AAT活性变化在种质间存在差异,在果实成熟末期活性增强或略有下降。[结论]AAT是菠萝蜜果实特征香气物质形成的关键酶。