木薯MeEIN3.1基因克隆及其在采后生理性变质中的信号转导

【目的】ethylene insensitive 3/ethylene insensitive-like 1(EIN3/EIL1)是乙烯信号通路的重要成员,克隆并分析其在木薯块根采后生理性变质(post-harvest physiological deterioration,PPD)过程中的表达情况,可以为深入研究乙烯信号在木薯块根PPD过程中的功能提供参考。【方法】通过RT-PCR技术从木薯栽培品种SC8中克隆得到了木薯MeEIN3.1基因,然后对MeEIN3.1基因的遗传进化关系、结构域、蛋白质结构、理化性质等进行分析。对MeEIN3.1蛋白进行亚细胞定位,并通过荧光定量PCR和酵母双杂交技术对MeEIN3.1基因在木薯块根PPD过程中的表达水平以及下游互作转录因子进行分析。【结果】MeEIN3.1基因的长度为1452 bp,编码483个氨基酸残基,等电点和分子质量分别为5.08和55.12 ku,氨基酸序列包含7个EIN3/EIL1结构域,和橡胶HbEIN3-like基因的亲缘关系最近,序列一致性为69.35%。MeEIN3.1蛋白的亚细胞定位结果显示该基因位于细胞核。荧光定量PCR结果显示,在木薯块根的PPD过程中MeEIN3.1基因的表达量和对照0 h相比,表现为显著上升趋势,即MeEIN3.1基因的表达受到PPD过程的诱导。另外,酵母双杂交结果显示MeEIN3.1能够与MeERF1.2和MeERF1.3产生互作。【结论】MeEIN3.1基因的表达在采后过程中受到诱导,推测其通过下游转录因子MeERF1.2和MeERF1.3进行乙烯信号转导来参与木薯块根的PPD过程。

木薯储藏根采后生理性变质研究进展

木薯(Manihot esculenta Crantz)是热带、亚热带地区重要的粮食作物和能源作物。木薯产量很高,储藏根富含淀粉,但收获后采后生理性变质严重,严重影响了木薯的开发和利用。结合近期研究工作,综述了木薯储藏根采后生理性变质的研究进展,包括采后生理性变质的检测标准、生化基础、抗采后生理性变质的杂交育种、以活性氧自由基为主要研究对象的功能基因组学与基因工程、应用前景及存在的问题,以期为木薯储藏根采后生理性变质的遗传改良提供参考。

几种抑制木薯采后生理性变质发生方法的比较

比较了热激、酸化和隔绝氧气3种处理对木薯采后生理性变质的影响,结果显示,热激和酸化都能在一定程度上延缓木薯PPD的发生,隔绝氧气是最为理想的抑制木薯PPD发生的方法。因此,通过过量表达或者干扰某些基因表达,降低以至于去除伤口处的氧气的方法将是防治木薯采后生理性变质的有效途径。

木薯采后生理性变质对酒精发酵的影响

比较了存放4 d的7种木薯(华南5号、华南8号、华南124、华南205、南植199、阿根廷7号和KU50)与对照发生采后生理性变质和出酒率的差异,结果表明,存放4 d的7种木薯的出酒率都低于对照,但与木薯采后生理性变质发生的程度没有相关性。这说明存放会降低木薯的出酒率,而初期的木薯PPD不会影响酒精发酵的产量。

木薯MePYL12基因克隆及采后生理性变质过程的表达分析

【目的】脱落酸受体PYL家族基因为ABA信号通路的重要成员。研究PYL基因在木薯块根的采后生理性变质(post-harvest physiological deterioration,PPD)和非生物胁迫中的功能,能够为进一步研究ABA信号在木薯抗逆和PPD过程中的功能奠定基础。【方法】本研究从木薯品种SC124中通过RT-PCR技术克隆得到了MePYL12基因,对它的蛋白质进行相关生信分析,如遗传进化关系、结构域、蛋白质结构预测、理化性质及基因的启动子元件分析,同时对MePYL12基因在相关处理和木薯PPD过程中的表达量进行分析。【结果】(1)克隆得到的MePYL12长度为567 bp,氨基酸数量为188,理论等电点为5.55,三级结构预测显示含有典型PYL螺旋手柄结构,与蓖麻和橡胶树中PYL蛋白序列的相似性较高,达到了86.77%和94.68%。MePYL12基因的蛋白序列含有PYL蛋白家族的保守结构域,特别是ABA结合的区域“Latch”和“Gate”序列100%一致,这些结果表明MePYL12基因编码的蛋白质属于PYL家族成员并且高度保守。(2)10个木薯组织中的MePYL12基因表达分析显示,该基因在分生组织和叶片中的表达水平最高。(3)MePYL12基因主要的启动子元件为光应答元件(Light-responsive motifs)、干旱诱导元件(Drought-induced motif)、ABA应答元件(ABA responsive motif)等元件。(4)MePYL12基因的表达水平显著受到干旱胁迫和ABA处理诱导。在木薯块根的PPD过程也被显著诱导,在6 h达到最高,随后慢慢下降。【结论】MePYL12基因具有提高植物应对非生物胁迫能力的潜能,同时可能参与了木薯块根的PPD过程,也为后续研究相关功能奠定了基础。

粉葛PtERF98基因克隆及表达分析

乙烯响应因子(ethylene responsive factors,ERF)是植物特有的一类转录因子,在乙烯信号转导通路、植物生长发育和逆境胁迫响应中起重要的调控作用。为探明PtERF98转录因子在粉葛(Pueraria thomsonii Benth.)块根采后生理性变质(post-harvest physiological deterioration,PPD)过程中的表达调控机制,本研究采用RT-PCR技术从火山粉葛叶组织中克隆PtERF98基因,并对其进行生物信息学、组织表达特异性分析和在PPD过程中的表达分析。结果显示,PtERF98基因CDS序列长450 bp,编码149个氨基酸残基;PtERF98蛋白理论分子量为16.93 kDa,理论等电点为8.06,为亲水性不稳定蛋白。蛋白结构分析显示,PtERF98具有典型的AP2保守结构域,属于ERF转录因子家族成员,定位于细胞核,无跨膜螺旋结构,含有1个信号肽和16个磷酸化位点。氨基酸序列同源性和系统进化关系分析表明,PtERF98与大豆(Glycine max)GmERF98同源性最高且亲缘关系最近。组织表达分析显示,PtERF98基因在火山粉葛的根、茎、叶中均有表达,且在不同组织中的相对表达量存在差异,叶中表达量最高。此外,PtERF98的表达受到PPD的显著诱导,表达水平随着PPD时间延长呈先升高后下降趋势,并在采后48 h达到最高,推测该基因可能参与粉葛块根的PPD过程。本研究可为深入了解PtERF98基因的功能及其在粉葛PPD过程中的表达调控作用奠定研究基础。

木薯MeHSF7基因克隆及表达分析

【目的】克隆木薯热激转录因子(HSF)基因MeHSF7并分析其在抗逆响应和采后生理性变质(PPD)过程中的表达情况,为研究MeHSF7基因在响应干旱胁迫及延缓生理性变质的调控机制提供理论参考。【方法】通过同源克隆从木薯叶片克隆MeHSF7基因,对其生物信息学和组织表达特性进行分析,并明确其在干旱和脱落酸(ABA)处理下及PPD过程中的表达模式。【结果】克隆获得的MeHSF7基因开放阅读框(ORF)为1206 bp,编码401个氨基酸残基,与参考序列(Manes.02G087400.1)仅存在2个碱基差异,位于第2染色体上,含有1个内含子和2个外显子。MeHSF7蛋白理论分子量46.1 kD,理论等电点(pI)5.95,为不稳定蛋白,定位于细胞核,无跨膜区域,含有HSF蛋白的保守结构域DBD(DNA结合功能域)、HR-A Core和HR-B Core,属于HSFA亚家族,与橡胶树和麻疯树HSF蛋白的氨基酸序列同源性最高,分别为79.20%和64.95%,在系统发育进化树上与橡胶树HSF蛋白聚在同一小分支,表明二者亲缘关系较近。MeHSF7基因在不同组织中的表达量均较低,但不同组织间存在明显差异,在松散性胚性愈伤组织、分化胚组织、须根和根顶端分生组织中的表达量相对较高,在叶柄中的表达水平最低。MeHSF7基因启动子区域含有ABA响应元件(ABRE)、干旱诱导元件(MBS)和光响应元件(ACE、Box 4)等。干旱处理下,MeHSF7基因表达量随处理时间的增加整体上呈升高趋势,在处理7 d后达峰值;在ABA处理下,处理5和7 d后MeHSF7基因表达量较处理0和3 d后明显上调,尤其在处理5 d后达峰值,表明MeHSF7基因表达受干旱和ABA处理的诱导。在木薯块根的PPD过程中,MeHSF7基因表达量随暗培养时间的增加而升高,处理6、12和48 h的表达量分别是处理0 h的2.1、2.2和3.2倍。【结论】MeHSF7基因可能在转录水平通过依赖于ABA信号通路的途径响应干旱胁迫及木薯块根的氧化胁迫,可作为候选基因用于研究其在木薯抗逆和采后储存中的调控功能。

木薯MeERF1.2基因克隆及表达分析

【目的】乙烯响应因子(Ethylene response factor,ERF)是乙烯信号转导通路的重要成员,克隆并分析其在木薯块根采后生理性变质(Post-harvest physiological deterioration,PPD)过程中的表达情况,能为进一步研究乙烯信号在木薯PPD过程中的功能提供参考。【方法】以木薯栽培品种华南8号(SC8)为材料,采用RT-PCR技术克隆木薯MeERF1.2基因,对其进行相关生物信息学分析,如遗传进化关系、结构域、蛋白质结构预测、理化性质等。对MeERF1.2基因在细胞中的亚细胞定位进行确认,并用qRT-PCR技术分析MeERF1.2基因在木薯块根PPD过程中的表达水平。【结果】克隆得到的MeERF1.2基因全长为660 bp,编码的氨基酸残基数为219,分子量和等电点分别为25.04 kD和5.61,含有AP2家族结构域,和橡胶HbERF1B-like的亲缘关系最近,序列相似性达到88.74%。MeERF1.2基因定位于细胞核。和对照0 h相比,MeERF1.2基因的表达量在木薯块根的采后过程中表现为显著上升趋势,即MeERF1.2基因的表达受到PPD过程的诱导。【结论】克隆得到的MeERF1.2基因包含ERF基因家族的保守结构域,属于ERF基因家族;MeERF1.2基因的表达在采后过程中受到诱导,可能参与了木薯块根的PPD过程,为后续进一步分析乙烯信号转导通路在PPD过程中的作用奠定了基础。

木薯2C型蛋白磷酸酶基因MePP2C55的克隆及表达分析

2C型蛋白磷酸酶(protein phosphatase 2C,PP2C)基因是ABA信号途径中主要组成部分,为分析其在木薯非生物胁迫和块根采后生理性变质(post-harvest physiological deterioration, PPD)中的作用,采用RT-PCR技术从木薯叶片(SC124)中克隆得到MePP2C55基因。对MePP2C55基因的理化性质、保守结构域、遗传进化关系、蛋白质结构预测及基因的启动子元件进行了预测和分析,并对MePP2C55基因在不同处理和PPD过程中的表达进行了分析。结果显示:(1)MePP2C55基因全长1 100 bp,编码369个氨基酸残基,蛋白相对分子量40.7 ku,理论等电点为7.57,含有PP2C的家族结构域。蛋白质序列分析显示,MePP2C55与橡胶树和麻风树的PP2C最相似,分别为88.80%和80.60%。MePP2C55和其他PP2C一样,在C-端保守。这些结果均表明,MePP2C55基因属于PP2C家族。(2)MePP2C55基因在不同木薯组织中的表达均较高,在侧芽和叶柄中最高。(3)MePP2C55基因属于ABA核心通路,所以启动子序列分析显示含有10个ABRE (abscisic acid responsiveness)元件。MePP2C55基因能被PEG和ABA处理显著诱导,且在PPD过程中也能被显著诱导。从上述结果可推测,MePP2C55基因具有提高植物应对非生物胁迫的潜力,同时也参与了PPD过程,为下一步研究该基因在木薯采后和抗逆中的功能提供了线索。

木薯MeHSF18基因克隆及表达分析

【目的】热激转录因子(Heat Shock Transcription Factor,HSF)在植物非生物胁迫响应过程中起重要调控作用。【方法】本研究利用PCR技术从木薯中克隆得到一个HSF家族基因,命名为MeHSF18,对其理化性质、蛋白结构域和进化关系、基因表达水平进行了分析。【结果】该基因的开放阅读框全长为867 bp,编码289个氨基酸,其蛋白质分子量为31.67 kDa,等电点为5.90。对其进行序列比对分析表明MeHSF18基因的氨基酸序列与橡胶树和麻疯树中的氨基酸序列同源性最高。木薯11个组织的表达数据表明MeHSF18基因在根相关组织中都有高表达。另外,MeHSF18基因的表达能被干旱和ABA处理显著诱导。在木薯块根的采后生理性变质过程中MeHSF18基因的表达也被显著诱导。【结论】MeHSF18基因可能在转录水平参与ABA介导的木薯干旱胁迫响应和木薯块根的采后生理性变质,可作为候选基因进一步研究其在木薯抗逆和采后储存中的功能。

木薯MeHSF10基因克隆及表达分析

热激转录因子(heat shock transcription factor,HSF)是植物中重要的逆境调控因子。许多研究表明HSF可通过对信号通路下游的逆境相关基因进行调控而提高植物适应逆境的能力,如提高植株在干旱和氧化损伤等逆境中的耐受能力。为研究HSF在木薯抗逆和采后储存中的功能,该研究以木薯品种SC124为材料,通过RT-PCR技术从木薯叶片克隆得到一个木薯HSF家族基因,将其命名为MeHSF10。结果表明:(1)该基因全长为1098 bp,编码365个氨基酸残基,蛋白质相对分子量为40.7 kD,理论等电点为8.15,蛋白的亚细胞定位预测为细胞核。蛋白质序列分析结果表明MeHSF10与麻风树JcHSF和橡胶树HbHSF的相似性最高,分别为80.31%和90.54%。MeHSF10基因的蛋白序列含有HSF蛋白家族的保守结构域,如DBD、HR-A Core、HR-B Core、插入序列和核定位信号(nuclear localization signal,NLS),表明MeHSF10基因编码的蛋白质属于HSFC家族成员。(2)为分析MeHSF10基因在木薯不同组织中的表达情况,对该基因在木薯11个组织中的表达进行分析,结果表明MeHSF10基因在木薯所有组织中都有表达,在叶片中的表达最高。(3)MeHSF10基因的启动子序列元件分析结果显示其含有脱落酸(abscisci acid,ABA)响应(ABA responsive motif)、干旱诱导(drought-induced motif)和光响应(light-responsive motif)等元件。(4)表达分析结果也表明,MeHSF10基因能被干旱和ABA处理显著诱导,MeHSF10基因在木薯块茎的采后生理性变质过程中也被显著诱导表达。综上结果表明,MeHSF10基因可能在转录水平参与ABA介导的木薯干旱胁迫响应和木薯块茎的采后生理性变质,这为进一步研究其在木薯抗逆和采后储存中的功能奠定基础。

木薯转录因子MeERF117的克隆及表达分析

AP2/ERF(APETALA2/ethylene responsive factor)类转录因子是植物应答多种逆境胁迫机制中的关键组分,研究木薯AP2/ERF家族成员将有助于解析该家族在木薯抗逆胁迫中的功能。基于已有木薯基因组序列信息,以木薯块根cDNA为模板,克隆得到一段长度为927 bp的cDNA,命名为MeERF117,该基因编码308个氨基酸。MeERF117蛋白分子量为35.08 kD,且该蛋白仅含一个AP2/ERF结构域,属于ERF转录因子家族。在进化关系上,Me ERF117蛋白与巴西橡胶树的ERF蛋白最相近。亚细胞定位观察到MeERF117蛋白分布于细胞质和核中。实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR)方法检测MeERF117基因在木薯块根采后生理性变质(Post-harvest physiological deterioration,PPD)过程中的相对表达量,发现PPD的发生可提高MeERF117因子的表达水平,在PPD后期(48 h)时MeERF117的相对表达量是未发生PPD(0 h)时的2倍,表明木薯块根PPD的发生可诱导MeERF117基因的表达。本研究为后续深入解析MeERF117在木薯PPD过程的具体功能奠定基础,为培育抗采后生理变质的木薯品种提供潜在的基因资源。