DNA甲基化分析中重亚硫酸盐处理DNA转化效率的评估方法

为建立一种评估重亚硫酸盐处理DNA样本后胞嘧啶转化效率的有效方法,以两组不同的Taq Man q PCR检测梯度稀释的重亚硫酸盐处理和未处理的DNA标准品,建立转化与未转化的DNA Ct值以及对应的DNA拷贝数的标准曲线。使用相同的探针定量检测重亚硫酸盐处理后的DNA样本评估转化效率。结果显示该方法应用两组探针,根据相应的标准曲线,精确评估样本经重亚硫酸盐处理的转化效率。使用已知转化和未转化拷贝数的混合DNA作为模板,证实了该方法的可靠性。同时也对不同重亚硫酸盐试剂盒处理DNA的转化效率进行了评估,结果显示,该方法能够有效地评估DNA样品重亚硫酸盐的转化效率,为DNA甲基化准确分析提供了可靠快捷的方法。

DNA甲基化及重亚硫酸盐测序法在药用植物中的应用策略

DNA甲基化是目前研究最为广泛的一种表观遗传学现象,甲基化后的DNA可在不改变碱基序列的情况下对植物的表型进行调控。在高等植物中有CG、CHG和CHH(H代表A、C或T)3种甲基化位点,多发生于对称序列CG和重复序列中,且不同物种中的甲基化程度和模式不同。药用植物功能基因启动子区域的DNA发生甲基化后,可抑制基因的表达,进而影响其次生代谢产物的积累,导致品质差异的形成。在众多的DNA甲基化检测方法中,重亚硫酸盐测序法可在单核苷酸水平上鉴别DNA甲基化的位点和程度,是DNA甲基化分析的金标准。对其进行引物优化、技术改良后,可有效地揭示药用植物的DNA甲基化情况,这为阐明经典遗传学不能完全解释的药用植物品质差异等问题提供了技术支持,并开辟了新的研究方向。

NEB全球首推甲基化领域的颠覆性技术革新:一种高效替代重亚硫酸盐转化的酶学转化法!

虽然重亚硫酸盐测序是研究DNA甲基化的金标准,但这种转化方式会对DNA造成损伤,导致DNA断裂、丢失和GC偏嗜。NEBNext酶学转化法甲基化建库试剂盒(EM-seq■)提供了一种酶学方法代替全基因组重亚硫酸盐处理DNA(WGBS)的方法,并结合高效流程化的建库步骤,适用于Nlumina平台测序。

NEB全球首推甲基化领域的颠覆性技术革新:一种高效替代重亚硫酸盐转化的酶学转化法!

虽然重亚硫酸盐测序是研究DNA甲基化的金标准,但这种转化方式会对DNA造成损伤,导致DNA断裂、丢失和GC偏嗜。NEBNext酶学转化法甲基化建库试剂盒(EM-seq^TM)提供了一种酶学方法代替全基因组重亚硫酸盐处理DNA(WGBS)的方法,并结合高效流程化的建库步骤,适用于lllumina平台测序。

基于全基因组差异甲基化分析鉴别影响苏姜猪体重的候选基因

本研究旨在分析不同体重苏姜猪的全基因组DNA甲基化差异,以期筛选出影响苏姜猪体重的差异甲基化基因(differentially methylated genes,DMGs)。利用全基因组重亚硫酸盐测序(whole genome bisulfite sequencing,WGBS)技术分析了3头180日龄高体重和3头180日龄低体重苏姜猪的全基因组DNA的甲基化程度、差异甲基化区域(differentially methylated regions,DMRs)和DMGs,对DMGs进行GO和KEGG分析,鉴别影响苏姜猪体重的候选基因。结果显示,苏姜猪全基因组范围内胞嘧啶(C)的平均甲基化率为4.1%,胞嘧啶(C)甲基化平均98.41%发生在CG序列上,CG序列环境下外显子、内含子和3′UTR的甲基化水平高于启动子和5′UTR。本研究共检测出1657个DMRs和575个DMGs,8号染色体上DMRs分布最多,88.89%的DMRs的长度在500 bp以内,62.78%的DMRs分布在远端基因间区,98个DMGs显著富集于TOR信号的负调控、碳水化合物衍生物分解代谢过程、脂肪细胞因子信号通路、FoxO信号通路等53个GO条目和29个信号通路,鉴别到5个与苏姜猪体重相关的候选基因:瘦素受体(leptin receptor,LEPR)基因、肿瘤坏死因子受体相关因子6(tumor necrosis factor receptor associated factor 6,TRAF6)基因、生肌因子6(myogenic factor 6,MYF6)基因、钙依赖性分泌激活因子2(calcium dependent secretion activator 2,CADPS2)基因和表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)基因。本研究利用WGBS绘制了高、低体重组苏姜猪的全基因组DNA甲基化图谱,为深入研究苏姜猪体重差异的分子机制奠定了基础。

感染大片形吸虫水牛脊髓全基因组DNA的甲基化及其功能的分析

为探究感染大片形吸虫后不同时间水牛脊髓全基因组DNA甲基化的类型、占比及其感染后差异甲基化区域(DMR)涉及的功能及信号通路,本研究将大片形吸虫囊蚴经口灌胃感染8~10月龄水牛,分别于感染后3 d(J01)、10 d(J02)、28 d(J03)、42 d(J04)、70 d(J05)和98 d(J06)采集水牛脊髓,利用全基因组重亚硫酸盐测序技术(WGBS)对基因组DNA的甲基化测序,测序数据经过滤筛选后,采用Bismark软件分析各组水牛脊髓基因组DNA甲基化的类型及其占比(某种类型甲基化序列在该组全部可用测序序列中的占比以及该组某种C类型甲基化的数量在全部C类型甲基化中的占比),并采用weight methylation level对各组水牛脊髓基因组DNA 7个功能区域的甲基化进行聚类分析。WGBS测序结果经过滤后显示,平均每组测序长度为100.29 Gp,Q20%(质量值≥20的碱基占总碱基数的百分比)和Q30%分别达到95%和85%以上,6组样品亚硫酸盐(BS)转化率均大于99%,表明WGBS测序结果准确可靠;各组样品DNA甲基化类型和占比的分析及统计结果显示,J01~J06组基因组分别包含CG、CHG、CHH 3种类型的甲基化(mCG、m CH及m CHH),且以m CG类型占比最多(63.1%~71.7%,80.11%~85.73%),m CHH类型(0.9%~1.2%,11.27%~15.18%)及m CHG类型均较少(1.0%~1.2%,3.00%~4.84%);聚类分析结果显示,上述3种类型的甲基化主要分布在水牛脊髓基因组第1内含子和内部内含子。上述结果表明,感染大片形吸虫后水牛脊髓基因组DNA甲基化类型以m CG为主,且第1内含子和内部内含子的甲基化可能影响该两个区域相关基因的正常表达。利用R软件包分析各组水牛脊髓基因组之间是否存在DMR,并采用基于模型的亚硫酸氢盐测序数据分析(MOABS)筛选并统计各组之间的DMR及DMR的数量;采用DAVID软件分析各组DMR在其相应基因组中的分布;采用R语言对各组的DMR进行GO功能注释和KEEG富集分析。DMR的筛选及统计结果显示,各基因组间均存在DMR,且各组间均以CG类型DMR数量的差异最大。其中,J06与J01(7134个)、J06与J02(7174个)、J06与J03(6743个)、J04与J03组(11611个)之间DMR数量的差异最大,且96.42%~99.04%的DMR分布在基因组基因间区,0.96%~3.59%的DMR分布在基因组启动子区。DMR的GO功能分析显示,各组间CG类型DMR的GO功能注释结果基本相似,主要富集在细胞进程、生物调节、代谢过程、结合及催化活性等生物学过程;KEGG分析结果显示,各组间尤其是在感染后期(J06组和J04组)DMR主要富集在癌症及PI3K-Akt等信号通路中。上述结果表明,在大片吸虫慢性感染的过程中,尤其在感染中后期对水牛脊髓基因组基因间区相关基因的表达有影响,且甲基化的DNA可能主要通过以上两个信号通路影响相关基因的表达,进而影响水牛脊髓的各种生物学功能,最终引起水牛中枢神经系统疾病。这在一定程度阐释了寄生在肝脏的片形吸虫影响宿主中枢神经系统的机制。本研究为深入探究大片形吸虫感染对水牛神经系统的影响机制奠定了实验基础。

大黄素通过减少DNMTs的表达对胰腺癌细胞抑癌基因ppENK发挥去甲基化作用研究

目的研究大黄素对胰腺癌细胞Panc1 DNA甲基转移酶(DNA methyltransferases,DNMTs)的影响,及其对抑癌基因前脑啡肽原(pre-proenkephalin,ppENK)启动子区CpG岛的去甲基化作用,探讨大黄素是否可通过降低DNMTs的表达逆转ppENK的甲基化状态。方法CCK-8检测不同浓度大黄素对Panc1细胞生长的影响,探索最佳用药浓度,重亚硫酸盐测序PCR(bisulfite genomic sequencing PCR,BSP)检测不同浓度大黄素对ppENK基因甲基化状态的影响,PCR和Western Blot检测ppENK及甲基转移酶DNMT1、DNMT3a的mRNA和蛋白表达情况。结果大黄素以时间梯度和浓度梯度依赖性抑制Panc1细胞生长,其半数最大抑制浓渡(half maximal inhibitory concentration,IC50)约为40μmol/L,大黄素可使ppENK甲基化状态减弱,非甲基化状态增强;可减弱DNMTs的mRNA和蛋白表达,增强ppENK mRNA和蛋白表达。结论大黄素可不同程度地使Panc1 ppENK抑癌基因去甲基化,使抑癌基因重新表达。大黄素抑制胰腺癌细胞生长和其去甲基化作用有关,推测大黄素发挥去甲基化作用和其抑制甲基转移酶表达相关。

两种方法检测胃癌患者CHFR基因启动子区甲基化的状态

背景与目的:目前认为CpG岛甲基化导致转录抑制是恶性肿瘤发生的重要机制之一。微管抑制剂诱发有丝分裂应激时,CHFR基因能够控制细胞分裂的进行。本研究检测胃癌中CHFR基因启动子区甲基化状态,探讨该基因甲基化状态与胃癌临床病理特征的关系;并比较甲基化特异性PCR方法(methylation-specific polymerase chain reaction,MSP)和结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法(combined bisulfite restriction analysis,COBRA)在检测胃癌组织CHFR基因甲基化状态的差异性。方法:首先采用MSP方法检测64例胃癌患者胃癌组织和相对应的癌旁正常组织中CHFR基因启动子区的甲基化状态,然后采用COBRA方法检测64例胃癌患者胃癌组织中CHFR基因启动子区的甲基化状态,并将检测结果结合各病例的临床特征进行分析。结果:MSP方法检测结果显示,51.6%的胃癌组织和18.8%的癌旁正常组织中存在CHFR基因异常甲基化,两者之间的差异有统计学意义(P<0.001);CHFR基因启动子区异常甲基化状态在不同临床病理学特征(包括年龄、性别、肿瘤大小、病理分期、Borrman分型、肿瘤浸润深度、组织分化程度和淋巴转移程度)的胃癌组织和癌旁组织中的差异无统计学意义(P值均>0.05)。COBRA方法检测结果显示,肿瘤组织CHFR甲基化阳性率为42.2%(27/64),与MSP方法检测结果的差异无统计学意义(P>0.05)。结论:CHFR基因异常甲基化是胃癌发生过程中的频发事件,检测胃黏膜组织中CHFR基因异常甲基化状态可能有助于胃癌的诊断。对于胃癌组织CHFR基因启动子区甲基化的检测,MSP与COBRA两种方法没有明显差异。

西藏小型猪IGFBP-3基因甲基化与表达差异分析

为研究西藏小型猪类胰岛素生长因子结合蛋白3(IGFBP-3)基因甲基化及表达差异,对IGFBP-3基因的CpG岛甲基化程度、mRNA及蛋白表达水平进行分析,并以军牧一号猪为对照。结果表明:西藏小型猪肝脏组织中IGFBP-3基因CpG岛甲基化水平显著高于军牧一号猪(P<0.05);西藏小型猪不同组织中IGFBP-3mRNA表达量均显著高于军牧一号猪(P<0.05);同时肾脏中IGFBP-3蛋白含量显著高于军牧一号猪(P<0.05)。这为猪生长发育调控及促生长机制提供了分子依据。

表观遗传学研究方法进展

表观遗传调控是基因表达调控的重要组成部分,已成为当前研究的热点。目前其研究主要集中在DNA甲基化和组蛋白修饰。针对这两种表观修饰,其研究方法也取得了较大进展,一方面方法的灵敏度和特异性都在不断提高;另一方面表观修饰的检测正在逐步从定性检测向定量分析方向发展,从个别位点向高通量检测发展。此外,新一代测序技术的应用将大大推动表观遗传研究的发展,包括单分子实时测序法、单分子纳米孔测序法等。综述目前常用的DNA甲基化、组蛋白修饰研究方法以及最新的单分子测序技术,并对它们在表观遗传修饰检测中的应用作了简要对比分析。

DNA甲基化研究方法的回顾与评价

DNA甲基化是表观遗传学的重要组成部分,在维持正常细胞功能、遗传印记、胚胎发育以及人类肿瘤发生中起着重要作用,是目前新的研究热点之一。随着对甲基化研究的不断深入,各种各样甲基化检测方法被开发出来以满足不同类型研究的要求,这些方法概括起来可分为3类:基因组整体水平的甲基化检测、基因特异位点甲基化的检测和新甲基化位点的寻找。该文主要介绍目前应用的大部分DNA甲基化研究方法,并对其相关特性进行简要分析与总结。

O01/O02基因型表现为B^(el)表型的分子研究

目的研究健康献血者ABO血型血清型和基因型不符的分子遗传背景。方法对1例ABO血型正反定型不符标本,进行血型血清学鉴定和ABO基因分型。在分析其ABO基因全编码区序列后,进一步对基因5’端表达调控区约5kb范围进行DNA序列分析,并分别以MKN28、KatoⅢ细胞株和正常ABO表型gDNA为对照,以重亚硫酸盐修饰法定量分析先证者ABO基因启动子区域CpG岛甲基化水平,观察CpG岛可能包含的表观遗传学信息。结果先证者红细胞正定型为O型,反定型为B型,吸收释放试验B抗原强阳性,血清糖基转移酶GTB阳性,确认其血清型为Bel表型。

干旱锻炼对B73自交后代当代干旱胁迫记忆基因表达及其启动子区DNA甲基化的影响

植物可能会记住已有的逆境刺激,且这种记忆可以跨代遗传。为研究G_(0)代干旱锻炼对玉米B73 G_(1)代当代干旱胁迫记忆基因表达的影响及其启动子区DNA甲基化的影响,实验用20%PEG-6000模拟干旱条件,选取在玉米和拟南芥已知的当代均具有干旱胁迫记忆特性的6个基因为研究对象,利用qRT-PCR技术分析这些基因的表达水平变化,并进一步利用重亚硫酸盐测序PCR技术分析在2个世代中表达差异最显著基因启动子区的DNA甲基化率变化规律。结果表明:干旱胁迫上调了6个当代胁迫记忆基因的表达水平,均呈+/+模式,同当代多次干旱胁迫时表达水平变化趋势一致,且G_(1)代表达水平显著高于G_(0)代;干旱胁迫降低了GRMZM2G_(0)88396基因启动子区的甲基化水平,检测区1两个世代DNA甲基化率的降低主要由CHG和CHH甲基化水平降低造成,检测区2 DNA甲基化率的降低主要是由CG和CHH甲基化水平降低造成,G_(1)代2个检测区总胞嘧啶甲基化率均显著低于G_(0)代,说明G_(0)代干旱锻炼使G_(1)代GRMZM2G_(0)88396基因启动子区的DNA甲基化修饰产生了可遗传的变异,它可能直接参与GRMZM2G_(0)88396基因的表达。

人类胚胎干细胞分化前后CDCA8基因启动子区甲基化状态的实验研究

目的:分析在人类胚胎干细胞分化过程中,CDCA8基因启动子区甲基化的状态。方法:生物信息学预测人类CDCA8基因上游2 kb区域的CpG岛。抽提未分化和自然分化的人类胚胎干细胞gDNA,应用重亚硫酸盐修饰和DNA序列分析方法检测CDCA8基因启动子区CpG岛甲基化情况。结果:未分化和自然分化的人类胚胎干细胞中,被检测的CDCA8基因启动子区CpG岛均未发现明显的甲基化修饰。结论:在人类胚胎干细胞分化前后,CDCA8基因启动子关键区域的甲基化状态未发生明显改变。

猪MKRN3基因启动子区CpG岛在胚胎心脏组织甲基化模式分析

以梅山猪-大白猪正反交为模型,以65日龄和100日龄的胚胎心脏组织为研究材料,对MKRN3基因启动子区CpG岛进行预测,根据预测的CpG岛设计引物,采用重亚硫酸盐测序法(BSP法),分析MKRN3基因启动子区CpG岛在胚胎心脏组织的甲基化程度。结果显示:对于65日龄胚胎,猪MKRN3基因启动子区CpG岛在大白×梅山和梅山×大白杂交后代的胚胎心脏组织中均表现高度甲基化(75.6%、76.4%);对于100日龄的胚胎,大白×梅山杂交后代的胚胎心脏组织表现高度甲基化(80%),而梅山×大白杂交后代的胚胎心脏组织呈现低甲基化(35.6%)。由此可见,猪MKRN3基因启动子区CpG岛的甲基化模式随着正反交、胚胎发育时期不同而呈现出一定变化,即在胚胎发育65日龄时,正反交子代均具有高度甲基化;而在胚胎发育至100日龄,正交子代呈现高度甲基化,反交子代呈现低甲基化,说明在胚胎发育晚期父本或母本等位基因可能会发生明显的去甲基化。

应用BSP联合TA克隆测序检测胰腺癌中RASSF1A基因启动子区异常甲基化

目的:检测Ras相关区域家族1A(Ras association domain family 1A,RASSF1A)在胰腺癌细胞株中的甲基化和表达状态,探讨其启动子异常甲基化在胰腺癌发病过程中的作用。方法:采用重亚硫酸盐测序PCR(bisulfite genomic sequencing PCR,BSP)联合TA克隆测序检测胰腺癌细胞株PANC-1及胰腺癌组织、癌旁组织及正常胰腺组织中RASSF1A启动子区CpG岛的甲基化状态,以甲基化酶抑制剂5-aza-2-deoxycitydine(5-aza-dC)处理PANC-1,观察处理前后甲基化率变化情况,逆转录PCR观察RASSF1A的mRNA表达情况。结果:在PANC-1细胞中RASSF1A启动子的甲基化率平均为100.00%,在正常胰腺、癌旁及癌组织中平均分别为1.79%、93.75%和100.00%,与正常胰腺组织相比,胰腺癌旁及癌组织的RASSF1A启动子甲基化率明显增高(P<0.01),而癌旁及癌组织之间无明显差异(P>0.05)。在PANC-1细胞、胰腺癌组织及癌旁组织中RASSF1A基因无表达,在正常胰腺组织中RASSF1A基因呈阳性表达;PANC-1细胞经5-aza-dC处理后,RASSF1A的甲基化率下降(88.89%,P<0.05),mRNA表达无变化。结论:胰腺癌细胞株PANC-1及癌组织、癌旁组织RASSF1A基因表达与启动子区甲基化状态有关,启动子区的高甲基化导致PANC-1中RASSF1A基因的表达沉默。该基因异常甲基化有望成为胰腺癌的早期诊断指标和治疗靶点。

小鼠骨髓细胞中p16和Ralb基因启动区CpG岛的甲基化位点分析

抑癌基因p16和白血病致癌因子Ralb与白血病的发生密切相关,其启动子区CpG岛的甲基化对基因表达具有重要作用.本文旨在分析p16、Ralb基因启动子区CpG岛甲基化位点信息,并比较这两个基因在小鼠骨髓细胞和原代培养的骨髓细胞中甲基化状态的差异.运用"MethPrimer"软件预测p16、Ralb基因启动子区的CpG岛,设计甲基化特异性引物.利用重亚硫酸盐测序法(BSP)检测甲基化位点信息.结果显示,p16有1个CpG岛,岛上21个CpG位点全部未发生甲基化;Ralb有2个CpG岛,CpG岛1上的5个CpG位点全部呈甲基化状态,而CpG岛2上的17个CpG位点全部呈非甲基化状态,且小鼠骨髓细胞和体外原代培养的骨髓细胞中两基因的甲基化状态一致.表明p16、Ralb基因甲基化状态未受外界培养条件的影响而改变,提示在与两基因甲基化相关的研究中体外试验可替代体内试验.

大鼠Ins1基因启动子区域DNA甲基化状态的研究

目的:研究大鼠Ins1(Insulin 1)基因启动子在各种组织中DNA甲基化的状态及在转化分化过程中甲基化的变化情况,为从表观遗传学方面研究Ins1基因表达调控的机制奠定基础。方法:通过RT-PCR检测大鼠胰岛、大鼠胰岛素瘤细胞(INS-1)及大鼠肝干细胞(WB)中Ins1基因的表达情况。采用重亚硫酸盐测序法分析这三种细胞位于转录起始位点上游400 bp的Ins1基因启动子区域DNA甲基化的状态,并用焦磷酸测序法分析大鼠肺、脾、皮肤、小肠、脂肪和肝脏组织的甲基化状态及WB细胞转入PDX1慢病毒后甲基化的变化情况。结果:大鼠胰岛和INS-1细胞中Ins1基因高表达,启动子区域的甲基化程度非常低,而在大鼠肺、脾、皮肤、小肠、脂肪、肝脏组织和WB细胞中Ins1基因不表达,启动子区域的甲基化程度很高,当WB细胞转入PDX1慢病毒后可使Ins1基因启动子区域的甲基化程度降低。结论:Ins1基因的表达受甲基化调控,PDX1单个转录因子虽可降低Ins1基因甲基化程度但并不能使其完全去甲基化并表达Ins1基因。

荷斯坦奶牛β-氧化关键酶ECHS1基因甲基化分析

为了检测烯脂酰辅酶A水合酶短链1(ECHS1)的甲基化状态,以同源比对克隆的方法获得荷斯坦奶牛ECHS1部分片段的序列,首先预测甲基化数目,然后采用重亚硫酸盐转化测序(BS-Seq)的方法检测了所获得片段的甲基化状态。结果表明,该试验成功获得了ECHS1 459 bp的序列,其C+G含量为53.88%,含有28个Cp G岛,其中1号、2号、9号、11号、13号、14号、17号、22号、24号、27号位点所有个体都发生了甲基化。

食管癌Eca9706细胞中KRT19基因的甲基化及表达

背景与目的:KRT19基因位于17q21.2,编码CK19蛋白。KRT19基因启动子的甲基化在肾癌、神经母细胞瘤中已有报道,而在食管癌中鲜见相关报道。本文研究甲基转移酶抑制剂5-氮-2'-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)对食管癌Eca9706细胞株生长活性的影响,并探讨5-Aza-CdR对食管癌Eca9706细胞株KRT19基因甲基化及其表达的影响。方法:用MTT比色法检测不同浓度5-Aza-CdR处理前后Eca9706细胞的生长活性;用结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法(combined bi sulfite restriction analysis,C0BRA)检测应用5-Aza-CdR后与未用药对照组细胞的的KRT19基因甲基化状态;用Western blot法检测应用5-Aza-CdR后与未用药对照组细胞的KRT19基因蛋白的表达情况。结果:5-Aza-CdR对食管癌Eca9706细胞系的增殖有抑制作用,且呈时间、浓度依赖性;食管癌Eca9706细胞株存在KRT19基因启动子区的甲基化;对照组无KRT19蛋白的表达,应用5-Aza-CdR后可以恢复其蛋白表达。结论:5-Aza-CdR抑制食管癌Eca9706细胞的增殖;5-Aza-CdR可以逆转KRT19基因启动子区的甲基化,恢复其蛋白表达,KRT19基因启动子区的甲基化可能是其失表达的重要机制。这为食管癌诊疗提供了一个新的靶点。