基于多重长PCR靶向捕获测序技术的高同源SNP鉴定

为建立一种高同源区段的单核苷酸多态性(SNP)基因分型技术,通过构建本地Blast对SNP所在的200和400 bp区段进行同源性评估,并筛选出高同源区段的SNP。利用第一轮多重长PCR(polymerase chain reaction)捕获329个样本的9个高同源区段SNP所在的长片段,使用纯化后的第一轮PCR产物作为模板进行扩增子建库测序,检测样本共得2 928个SNP位点信息,测序成功率高达98.885 6%。利用Hardy-Weinberg(HWE)法则计算试验研究的9个高同源区段SNP位点的基因频率(p值均大于0.05,符合HWE法则),并与NCBI(national center for biotechnology information)中千人基因组数据库中获取的基因频率相比对,发现二者单碱基基因频率一致(误差限<0.15)。研究表明,利用多重长PCR靶向捕获技术结合二代测序技术为高同源区段的SNP分型提供一个准确、快速、大样本检测方案。

基于SSR标记检测与重测序技术的3个李品种鉴定与遗传背景简析

“玉带李”“青脆李”“蜂糖李”是熟期或外观相近的四川省主栽青皮李品种。为探索快速区分这3个青皮李品种的方法,对其果实成熟期与外观特征进行比较,采用前人公布的李属种质资源77对SSR标记进行分型,并使用基因组重测序技术简析其遗传背景。结果表明,29号引物和UDP98-021可以作为区分“蜂糖李”的分子标记,ASS R71可以作为区分“青脆李”的分子标记,再结合“玉带李”果实成熟期更晚和具水渍带状缝合线的特点,可以成功区分出这3个李品种。基于重测序技术的SNP、InDel变异检测及可视化分析结果表明,“玉带李”与其他两个品种的遗传背景差异较大,“青脆李”“蜂糖李”遗传背景高度相似。“玉带李”可以作为“青脆李”“蜂糖李”的配套授粉品种,是李品种改良的优良亲本。

基于转录组测序与定量PCR技术挖掘北沙柳株型相关候选基因

为构建北沙柳株型分子辅助育种体系实现高效定向育种,采用水培群体转录组测序与野外训练群体定量PCR分析相结合的方法,以RNA-Seq分析中的基因表达量(FPKM值)与冠高比(株型特征值)的相关系数作为预测值,探讨北沙柳株型相关候选基因挖掘技术。结果表明,北沙柳冠高比与FPKM值间存在相关性,在水培预测群体和野外训练群体中保持基本一致的趋势。文献中已报道的株型(或者分枝)相关基因(TAC 2、LAZY 1b、ZFP 4、TB 1、SPA 2、ABF 2和PYL 1)的预测值在0~0.6,ATX 1、RFK 1和FHY 1基因(未报道与株型相关)的预测值较高(0.6~1.0),按照“基因个数最少,相关系数最高”的原则,选择双基因组合ATX1+FHY 1作为鉴别北沙柳株形的基因。将形态学、转录组学作为一个整体来挖掘株型性状相关基因是本研究特色,研究结果也可为其他植物、其他性状的分子辅助育种提供理论基础。

PCR产物直接测序技术中影响因素的研究

探讨了PCR产物直接测序技术中的影响因素,结果表明:PCR产物特异性是影响其测序成败的关键因素,PCR反应只有产生惟一扩增产物时,其产物才能被用来直接测序;PCR反应体系残留混合物（dNTP、引物和盐离子等）对其测序质量有明显不利影响,PCR产物纯化后其测序质量能明显提高;同时,PCR产物大小不同,其测序反应的模板用量也不同,在一定长度范围内,最适模板用量随PCR产物长度增加而增加。

应用PCR-测序及SSCP技术分析mtDNA序列多态性

mtDNA以其拷贝数多、呈母系遗传、进化速度快等特点,为法医检案提供了一种有效的检测项目,特别是对微量、陈旧降解检材的DNA检验.应用PCR-自动测序和PCR-SSCP检测技术分析58例太原地区无关汉族个体mtDNA nt16081-16546区间(位于HV I)序列多态性,并对其进行统计学分析.

应用PCR产物直接测序技术测定乙型肝炎病毒前C区基因序列

目的 :测定乙型重型肝炎和慢性乙型肝炎患者血清中乙型肝炎病毒前C区基因序列 ,探讨乙型肝炎病毒前C区基因变异的意义。方法 :采用PCR产物直接测序技术 ,测定 13例乙型重型肝炎和 10例慢性乙型肝炎患者血清中乙型肝炎病毒前C区基因序列 ,并与基因库中来自世界各地的不同基因型的毒株进行比较。结果 :患者血清中乙型肝炎病毒前C区基因序列 ,除发现乙型肝炎病毒前C区基因 1896位存在点变异外 ,还可见 184 6位点变异 ,且乙型重型肝炎患者发生病毒变异的频率明显高于慢性乙型肝炎 (P <0 .0 5 ) ,而 186 2位未检出变异。 1838位核苷酸全部为腺嘌呤核苷酸 (A) ,184 6位核苷酸大多为胸腺嘧啶核苷酸 (T) ,仅 4例发生了G→A点突变。经与不同基因型的毒株进行比较 ,提示沈阳地区流行的乙型肝炎病毒毒株接近美国株。结论 :乙型重型肝炎患者发生病毒变异的频率明显高于慢性乙型肝炎 ;

qPCR-HRM曲线分析技术与普通PCR加直接测序法检测胶质瘤EGFR突变比较

目的:比较实时聚合酶链反应-高分辨率融解(qPCR-HRM)曲线分析技术和普通PCR法加直接测序法检测胶质瘤患者EGFR基因突变类型,探讨适用于临床的EGFR基因突变检测方法,为胶质瘤患者术后放射、化学治疗及预后判断研究提供可靠的依据。方法:用普通PCR加测序法与qPCR-HRM曲线分析技术检测胶质瘤患者EGFR基因突变类型,检测结果比较采用卡方检验。结果:两种方法检测EGFR外显子19基因突变结果比较差异无统计学意义,且qPCR-HRM曲线分析技术比直接测序法更快捷、灵敏。结论:与直接测序法相比,qPCR-HRM曲线分析技术可能更适用于临床检测胶质瘤患者标本EGFR突变性质。

基于全基因组重测序技术鉴定转基因大豆插入位点的方法

明确的插入位点及其旁侧序列是转基因材料进入生物安全评价更高阶段的必要条件。传统的插入位点鉴定方法以基于已知外源序列的PCR扩增技术为基础,主要有TAIL-PCR和Genome walk ing等。大豆是一个古四倍体农作物,近75%的基因以多拷贝或复杂拷贝的形式存在,因此,传统的以PCR为基础的插入位点鉴定方法在转基因大豆中工作效率并不高。

实时荧光PCR与DNA测序技术检测手足口病病毒结果分析

目的探讨实时荧光PCR与DNA测序技术检测手足口病病原体的临床价值。方法前瞻性选取2017年03月~2019年06月诊治的126例疑似感染手足口病患儿进行研究,经病毒分离培养确诊为手足口病共92例,且予以实时荧光PCR与DNA测序技术检测,对比检测后的阳性预测值、阴性预测值,以及EV、EV-71、CA-16检出率,评估实时荧光PCR与DNA测序技术诊断手足口病病毒的AUC值、敏感度、特异度及约登指数。结果126例疑似感染手足口病患儿经病毒分离培养确诊为手足口病共92例、百分比为73.02%;其中检出EV病毒48例、占52.17%,检出EV-71病毒32例、占34.78%,检出CA-16病毒16例、占17.39%;经实时荧光PCR检测后阳性例数为90例、阳性预测值为96.77%,检出EV病毒47例、占52.22%,检出EV-71病毒31例、占34.44%,检出CA-16病毒12例、占13.33%;与金标准相比,差异无统计学意义(P均>0.05)。经DNA测序技术检测后阳性例数为71例、阳性预测值为83.53%,检出EV病毒38例、占53.52%,检出EV-71病毒20例、占28.17%,检出CA-16病毒13例、占18.31%;低于金标准(P均<0.05);且实时荧光PCR的准确率均高于DNA测序技术,而误诊率、漏诊率低于DNA测序技术(P均<0.05)。ROC曲线分析显示,实时荧光PCR、DNA测序技术诊断手足口病的AUC分别为(0.945、0.680,P<0.05),敏感度分别为97.80%、77.20%,特异度分别为91.20%、58.80%。结论实时荧光PCR与DNA测序技术在手足口病病毒检测结果中,前者更加快捷,灵敏度、特异度更高。

利用重测序技术获取转基因植物T-DNA插入位点

T-DNA插入位点的获得对于植物功能基因组学研究及转基因植物的筛选鉴定非常重要,但是目前常用的方法如反向PCR、半随机引物PCR等,除了操作复杂、消耗时间长外,特异性较差,效率也很低。本研究利用全基因组重测序技术,将3份转基因材料基因组DNA打包后进行重测序,利用转基因载体序列作为参考序列进行比对分析,得到4个T-DNA插入位点。对3份转基因材料进行PCR和Southern blot验证分析,成功获得了3份转基因材料全部T-DNA插入位点,其中1份材料为2拷贝插入。本文利用重测序技术建立了一种简单、可靠、高效的获取转基因植物T-DNA插入位点的方法,以期为植物功能基因组学及转基因研究奠定基础。

基于重测序技术的塔河马鹿特异性SNP位点筛选

【目的】筛选出塔河马鹿高质量的单核苷酸多态性位点(SNP),构建特异性分子遗传标记,为塔河马鹿的纯种鉴别提供参考。【方法】对国家特种经济动物资源共享平台1999年收集整理的32份塔河马鹿血液DNA样本进行全基因组重测序,与梅花鹿染色体级别的参考基因组进行比对,统计比对率、覆盖度和测序深度。用SNPEff统计每条染色体上SNP位点的分布,用SNPhylo基于位点构建分子进化树,用VCFTOOLS计算遗传分化指数(Fst),按降序排序并设定阈值Fst≥0.25,淘汰不符合条件位点,用R语言进行主成分分析(PCA),统计33条染色体排名前1500的SNPs位点,提取前100个SNPs集合的特征值,分别进行主成分分析。【结果】全基因组重测序结果表明,32份质检合格的塔河马鹿血液基因组DNA有效数据量为868791354600 bp,测序质量均符合后续数据分析要求。32份样品测序数据的平均比对率为98.06%,平均覆盖度为97.66%,平均深度为6.787。过滤后得到20139122个高质量的SNPs位点,其中4号染色体上SNPs分布最多,90%以上的变异位于基因间和外显子区域。建树后候选特异性SNPs位点数为12050781个。使用VCFTOOLS筛选得到544717个SNPs位点。选取每条染色体排名前1500的SNPs位点进行主成分分析,主成分分析结果显示,当SNPs从49500降至100时区分效力没有下降,最终筛选出100个特异性强、稳定性高的塔河马鹿SNPs位点。【结论】通过全基因组重测序技术和生物信息学分析得到了100个塔河马鹿特异性SNPs位点,为塔河马鹿的纯种鉴别以及核心种质的筛选工作提供了理论依据。

基因测序技术在发现昆虫体内噬菌体中的应用

采用系统综述评价利用基因测序技术发现昆虫体内噬菌体的可行性。以“宏基因组”“扩增”“昆虫”“肠道微生物”“噬菌体”“metagenomics”“amplification”“insects”“gut microbes”“phage”为关键词,通过PubMed、中国期刊全文数据库(CNKI)、万方数据库及维普数据库对2000年1月至2022年6月发表的相关文献进行检索。按照纳入、排除标准筛选文献并对纳入文献进行定性分析。结果表明,根据纳入、排除标准,从227篇文献中筛选出合格的文献8篇,其中1篇为利用宏基因组测序技术从昆虫体内分离出噬菌体,其余7篇文章均为通过基因扩增测序技术发现昆虫体内存在WO噬菌体相关序列。宏基因组测序技术及基因扩增后测序均可发现昆虫体内是否存在噬菌体。宏基因组测序技术与PCR扩增测序技术结合可了解昆虫肠道内微生物的丰度及功能,以及噬菌体侵染情况和种类分布情况。

高通量测序技术在农业研究中的应用

随着高通量测序技术的不断发展和测序成本不断降低,高通量测序近几年在现代农业研究领域中得到了充分应用,为新品种选育和品质改良带来了新的科研方法和解决方案,加快了新品种的育种进程。高通量测序技术的主要应用方向包括对农作物和栽培品种进行全基因组从头测序和深度重测序、遗传差异分析、分子标记开发、遗传连锁分析、表观遗传分析和转录组分析等。本文系统阐述了近几年高通量测序技术在农业研究中的应用进展,展示高通量测序在现代农业研究领域的广泛应用前景。

基于重测序技术筛选工作犬OR基因SNP位点

鉴于犬的嗅觉能力突出,各国警方广泛应用训练有素的工作犬搜查爆炸物、毒品等违禁品打击和预防犯罪。工作犬的嗅探能力从根本上讲是受犬嗅觉受体(Olfactory receptor,OR)基因调控的,因此如果能够运用分子生物学技术开展工作犬嗅探能力与OR基因之间的关联性研究工作.

杜氏利什曼原虫:PCR分析技术和DNA测序显示苏丹分离株的种内多态性

作者采用单链非特异性引物的PCR指印技术、核糖体操纵子内转录间隔区扩增产物的限制性片段长度多态性分析(ITS-RELP)、单链构象多态性(SSCP)和ITS测序等法研究26个杜氏利什曼原虫分离株间的多态性,其中23个为东部苏丹分离株,另外3个虫株分别来自肯尼亚、印度和中国。

全基因组重测序在大豆育种上的研究进展

大豆是世界上最重要的油料作物之一。随着基因测序技术的快速发展及广泛应用,大豆育种研究受到了深刻的影响。本文简述了基因测序的主要方法及全基因组重测序在大豆育种、遗传转化研究中的应用,综述了目前全基因组重测序从发现突变位点、揭示进化关系、挖掘功能基因等基因功能和结构的角度,来研究大豆育种及疾病发生过程中的分子机理,为今后基因测序技术在大豆育种中的研究与应用提供参考。

菌落PCR产物直接测序方法的建立及在水稻基因测序中的应用

建立了以菌落PCR产物作为DNA测序模板进行快速测序的技术方法。研究结果表明,采用菌落PCR技术,以载体插入位点两端序列互补的通用引物(如M13正反向引物)为引物,在控制菌落PCR反应条件的情况下,不仅可用于筛选和鉴定阳性克隆,而且菌落PCR产物还可作为DNA测序模板,结果准确可靠。与常规质粒测序方法比较,该法快速、简便,但对具有PolyT、PolyA过多的序列进行测序时,该法测序效率较低。

PCR产物的高通量测序方法及优化

PCR产物的高通量测序被广泛应用于功能基因筛选、肿瘤相关基因的突变和甲基化检测等。在高通量测序技术中,建库和上机测序实验一直是决定最终DNA数据质量的关键。作者优化了PCR产物样品的DNA文库制备条件和体系,设计了适合PCR产物特点上机测序方法,将已建库的PCR样品中混入一定量的基因组标准品后再上机测序,由此保证了测序数据的高质量和低冗余度。为低多样性DNA样品高通量测序技术方法运用提供方法上的参考。

耐盐转基因大豆事件AtARA6-A001外源插入片段侧翼序列及其应用

转基因大豆AtARA6-A001事件采用农杆菌介导大豆遗传转化法获得,其受体为沈农9号,具有耐盐特性,目前已经进入环境释放阶段。为明确该转基因大豆材料的分子特征及其转基因检测方法,推进该转基因事件生物安全评价工作。本研究以转基因大豆AtARA6-A001为研究对象,利用Southern杂交方法及基因组重测序技术鉴定了外源基因的拷贝数及插入位点的位置和方向。同时利用PCR扩增技术获得了外源T-DNA的左右侧翼序列,并基于左右旁侧序列,建立了转AtARA6基因耐盐大豆A001事件的特异性定性PCR检测方法。此方法能特异性检测转基因大豆植株AtARA6-A001根、茎、叶、花和种子样品,并且能够特异性识别转基因大豆事件的身份,这为后续转基因大豆及其产品的检测和监管提供技术支持。