重叠区扩增基因拼接法在构建膜锚定金黄色葡萄球菌肠毒素A融合基因上的应用

目的 :将超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素 A(SEA)基因与人胎盘碱性磷酸酶 (h PL AP- 1) C末端信号肽序列进行拼接 ,形成融合基因。方法 :利用重叠区扩增基因拼接法 ,分别扩增 h PLAP- 1C末端信号肽序列和 SEA基因序列。然后 ,将二段基因拼接并与 p GEM- T克隆载体连接 ,酶切和测序鉴定。结果 :成功扩增出 h PLAP- 1C末端信号肽序列 131bp和 SEA基因序列 796 bp;经测序证实 ,二段基因序列成功拼接 (90 1bp)。结论 :重叠区扩增基因拼接法能将 SEA基因与 h PL AP- 1C末端信号肽序列拼接 ,形成融合基因。

重叠区扩增基因拼接法在构建膜锚定共刺激分子融合基因上的应用

目的 将小鼠共刺激分子 B7- 1(m B7- 1)基因的胞外区与人胎盘碱性磷酸酶 (h PL AP- 1) C末端信号肽序列进行拼接 ,探讨其形成融合基因的作用。方法 利用重叠区扩增基因拼接法 ,分别扩增 h PL AP- 1C末端信号肽序列和 m B7- 1基因的胞外区序列 ,然后将二段基因拼接起来 ,拼接后与 p GEM- T克隆载体连接 ,酶切和测序鉴定。结果 分别成功扩增出 h PL AP- 1C末端信号肽序列 15 5 bp和 m B7- 1基因的胞外区序列 76 4 bp,并将二段基因序列成功拼接 (891bp) ,经测序是正确的。结论 重叠区扩增基因拼接法能拼接 m B7- 1基因的胞外区与 h PL AP-1C末端信号肽序列 。

重叠区扩增基因拼接法拼接hIL-2信号肽基因和CVB3的VP1基因

目的 :将 h IL- 2信号肽基因拼接到 CVB3VP1基因的 5′端 ,以获得分泌型 VP1 (s VP1 )基因。方法 :采用重叠区扩增基因拼接法。结果 :凝胶电泳见到预期大小 DNA条带 ,经测序表明基因序列与报导的 h IL- 2信号肽及 CVB3VP1的基因序列一致。结论 :成功获得了融合基因 s

重叠区扩增法合成抗菌肽B基因

人工设计并合成了抗菌肽 B基因的 4个寡聚核苷酸片段 ,通过重叠区扩增法 ,扩增出了相当于抗菌肽基因全长的寡聚核苷酸片段。经克隆测序 ,证明成功地实现了抗菌肽基因的人工合成、拼接和克隆。

改良重叠区扩增法构建Rac1相关质粒

采用改良重叠区扩增法实现Rac1基因定点突变,构建人Rac1基因相关真核表达质粒,观察EGFP-Rac1融合蛋白在人正常肝细胞LO2中的表达。利用RT-PCR的方法得到Rac1基因,使用改良重叠区扩增法实现Rac1基因的定点突变,获得Rac1突变基因。将Rac1基因及Rac1突变基因通过限制性酶切技术及DNA连接技术插入真核表达载体pEGFP-C1中,获得重组质粒pEGFP-C1-Rac1,pEGFP-C1-Rac1V12和pEGFP-C1-Rac1N17。将上述质粒瞬时转染入LO2细胞中,采用荧光技术及Westernblotting检测目的基因的表达。结果显示,限制性酶切及基因测序证实质粒构建正确,转染LO2细胞后,融合蛋白EGFP-Rac1在细胞中高效表达。成功构建真核表达质粒,在LO2细胞中,该质粒能成功表达融合蛋白EGFP-Rac1。

C型乙型肝炎病毒基因SOEing法引入228位点突变

目的为获取乙型肝炎病毒(HBV)基因分型芯片病毒靶序列,对C型HBV第228位碱基进行点突变。方法通过不同基因型HBV全基因组的序列比对分析,显示基因型A,C,D,G在228位上的碱基为G,而基因型B,E,F,H为A,所以检测该位点的碱基类型可以实现HBV基因型的初步分型。结果将C型乙肝病毒第228位上的单位碱基由G突变为A,经测序后证明突变成功。结论重叠区扩增基因拼接法(SOEing)是一种简便引入点突变的方法,可以应用此法制备HBV基因分型芯片检测基因片段序列。

SOE-PCR法检测PRRSV ORF5缺失跨膜区的融合蛋白基因片段的研究

PRRSV为有囊膜的单股正链RNA病毒，含有8个开放阅读框（open reading frames，ORFs），其中ORF5—7分别编码PRRSV主要的结构蛋白：糖基化囊膜蛋白（E）、膜蛋白（M）和核衣壳蛋白（N）。糖基化囊膜蛋白（E）又称GP5蛋白，具有良好的抗原性和免疫原性，分子质量约为25ku。重叠延伸PCR技术简称SOE—PCR，又称重叠区扩增基因拼接法、交错延伸剪接PCR技术或套叠PCR技术。此技术利用PCR技术在体外进行有效的基因重组和定点突变，而且不需要内切酶消化和连接酶处理。研究在分析了GP5蛋白跨膜区之后，采用SOE—PCR的方法将跨膜区基因缺失，对GP5蛋白编码跨膜区外的基因片段进行了克隆，旨在为获得高表达、高活性的基因产物打下基础。

SOEing法构建EGFP真核表达载体及其在杜氏盐藻中的表达

通过重叠区扩增基因拼接法(Gene splicing by overlap extension,SOEing)构建含有杜氏盐藻(Dunaliella salina)硝酸盐还原酶(NR)基因5′-上游序列(Pnr)and 3′-端序列(Tnr)的EGFP真核表达载体,并将其转化杜氏盐藻。利用改进的SOEing法,将杜氏盐藻NR基因Pnr与报告基因EGFP cDNA融合,并与pEGM-7zf克隆载体连接,顺序将盐藻NR基因Tnr序列与融合片段相连,构建含Pnr-EGFP-Tnr表达盒的盐藻真核表达载体p7NET。电击法转化杜氏盐藻,在盐藻转化株中观察到了EGFP的瞬时表达。此研究为转基因杜氏盐藻研究和成功建立杜氏盐藻生物反应器奠定了实验基础。

SOEing法在构建人瘦蛋白乳腺表达载体中的应用

目的 :将奶牛CSN2 5′端启动子区与人瘦蛋白cDNA序列进行拼接 ,进而构建人瘦蛋白乳腺特异性表达载体。方法 :设计特殊的“巨型引物” ,运用PCR方法分别从质粒pBBC和pHL上扩增了牛CSN2 5′端启动子 ( 2 8kb)和有完整读码框的人瘦蛋白基因。利用改进的重叠区扩增基因拼接法 (SOEing法 ) ,将两个独立的片断进行了拼接。结果 :得到了两者线形融合基因 。

应用SOEing方法构建SOD1-G93A的真核表达载体

目的构建铜/锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn superoxide dismutase,SOD1)-G93A的真核表达载体。方法应用重叠区扩增基因拼接法(SOEing)分别扩增前段M1基因与包含突变位点的后段M2基因,然后将2段基因拼接起来,得到SOD1-G93A基因,并克隆至pcDNA3.1(-)真核表达载体上。结果成功扩增出SOD1-G93A基因,测序结果与GenBank完全一致;对重组质粒SOD1-G93A-pcDNA3.1(-)进行双酶切鉴定,测序结果与预期完全一致。结论成功构建了SOD1-G93A-pcDNA3.1(-)真核表达载体。

用改进的重叠区扩增基因拼接法构建中间缺失突变体

目的 构建缺失第 32 5～ 373位氨基酸密码子的磷脂酸磷酸化激酶β(phosphatidylinositol 4 - kinase beta,PI4 K-β)基因 ,以探索一种简便的构建中间缺失突变体的方法。 方法 应用重叠区扩增基因拼接法的原理 ,在拼接延伸后 ,再进行一次 PCR扩增 ,得到缺失第 32 5～ 373位氨基酸密码子的 PI4 K- β基因 ,克隆至 p CMV- Tag4 A真核表达载体。 结果 成功地构建出缺失第 32 5～ 373位氨基酸密码子的 PI4 K- β突变体。 结论 这种改进的重叠区扩增基因拼接法可以有效而可靠地构建中间缺失突变体 ,具有推广价值。

马槟榔甜蛋白基因(MBLⅡ)的拼接与表达载体的构建

从云南植物Capparismasaikai中提取总DNA,设计引物克隆马槟榔甜蛋白基因MBLⅡ,序列测定后经同源性分析表明与GeneBank中登陆的马槟榔甜蛋白基因MBLⅡ(cDNA)序列一致,表明MBLⅡ不存在内含子序列。利用重叠区扩增基因拼接法(genesplicingbyoverlapextension,geneSOEing)进行体外基因剪接,剪接片段与植物表达载体pVKH相连,构建pVKH-35S-MBLⅡ-Pa、pVKH-35S-S-A+B-pA、pVKH-35S-A+B-pA、pVKH-35S-S-A-pA、pVKH-35S-S-B-pA,为寻找mabinlin的活性表达形式和翻译后剪接机制打下基础。

抗菌肽天蚕素B基因及其串联体在毕赤酵母中的表达

通过重叠区扩增基因拼接法(SOE)合成抗菌肽天蚕素B基因,并在其N端引入Kex2酶切位点。亚克隆天蚕素B并将3个亚克隆串联在一起,每个单体前都加上Kex2酶切位点,将天蚕素B以及串联体克隆至表达载体pPICZαA上,用SacⅠ酶切使之线性化,采用电击法转化毕赤酵母SMD1168,转化子用小瓶发酵。经Tricine-SDS-PAGE检测,在α信号因子的引导下,表达产物可以分泌到培养基中,且具有明显抑菌活性。

膜联蛋白32与低分子质量单链尿激酶融合基因的构建及高效表达

目的：构建膜联蛋白32（annexin32，Anx32）和低相对分子质量单链尿激酶（ScuPA32k）的融合基因，并在大肠杆菌系统内作表达。方法：利用重叠区扩增法进行基因拼接，然后在谷胱甘肽S转移酶原核表达系统内表达，Western印迹验证表达产物。结果：重叠区扩增得到 1．8 kb融合基因，该基因在原核表达系统内得到高效表达，表达量占菌体总蛋白的 26％，Western印迹证明表达产物正确。结论：用重叠区扩增法进行基因拼接快速、简便。

利用套叠PCR和高保真DNA聚合酶进行基因多位点突变的研究

利用套叠PCR和高保真DNA聚合酶对人工合成的牛口蹄疫病毒VPI基因(FMDV-VPl,Foot-Mouth Disease Virus-VPl)的5个突变位点进行修复,修复的成功率为100％。

一种新融合抗菌肽Hex-Mag基因的克隆、表达及其抗菌活性的研究

通过在Magainin1-12(GIGKFLHSAKKF)的N端添加碱性氨基酸片段Hexapeptide(RRWQWR)以增强其对细胞膜的吸附能力来提高Magainin1-12的抗菌活性。利用Hexapeptide和Magainin1-12的基因序列,结合酵母偏爱密码子设计出新的融合基因Hex-Mag,通过重叠区扩增基因拼接法(Gene splicing by overlap extension,gene SOEing)利用PCR扩增出基因片段,再将融合基因进行酶切并纯化后导入穿梭质粒pPIC9中,构建受乙醇氧化酶1基因(AOX1)的启动子与转录终止区控制的酵母表达质粒,转化GS115毕赤酵母宿主菌,经表型筛选,阳性克隆用甲醇诱导表达。表达出的融合肽Hex-Mag分子量约2.3kDa,其耐热性强,在100℃条件下,其活性可维持3h以上。琼脂糖孔穴扩散法检测显示Hex-Mag对多种革兰氏阴性菌和阳性菌具有抑制活性,与Magainin1-12相比,其活性有明显增强,N端正电荷增加的预期效应得到初步体现。

乙型肝炎病毒基因生物信息学分析及特异片段的制备

目的制备HBV基因分型芯片模板。方法通过不同基因型HBV全基因组的序列比对,选取6个碱基位点作为分型位点,应用重叠区扩增基因拼接法(SOEing法)对C型HBV片段进行点突变。结果在所选位点上成功引入点突变。结论SOEing法是一种简便引入点突变的方法,可以应用此法制备HBV基因分型检测基因所需的模板DNA。

猪泛素基因与PRRSV GP5基因融合表达质粒的构建

采用RT PCR技术从长白猪的肌肉组织中扩增出了泛素 (Ubiquitin)基因 ,并将其克隆到 pGEM Teasy载体 ,经测序表明 ,所克隆的基因与GenBank中已登录的序列同源性达 99%。利用设计的融合表达引物 ,分别将泛素基因与猪生殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV )GP5蛋白成熟肽基因进行扩增 ,用重叠区扩增基因拼接法将 2个基因片段进行拼接 ,并插入真核表达载体 pcDNA4 .0HISMAXA中 ,构建出了 pcDNA U GP5重组质粒。

鹅FSH全基因的合成

为了合成鹅的FSH基因,本实验通过重叠区扩增法(PCR-baseda ccurate synthesis,PAS)人工合成鹅的FSH基因。根据GenBank中鹅FSH-α和β基因序列,分别设计并合成12条引物,人工合成鹅FSH基因并构建其克隆载体。经过鉴定和测序结果证实PAS合成序列为FSH的基因序列。该基因的合成为后续研究FSH基因对鹅产蛋性能的影响奠定了基础。

HBV X-HCV C融合基因重组腺病毒的构建及鉴定与表达

目的:应用重叠区扩增基因拼接法(gene SOEing)获得HBV X-HCV C融合基因,构建HBV X-HCV C融合基因重组腺病毒。方法:应用gene SOEing法扩增HBV X-HCV C融合基因并将其克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV,获得重组腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV-XC,经PmeⅠ酶切线性化后电转化BJ/AdEasy菌,构建重组腺病毒质粒pAd-XC;鉴定正确的pAd-XC经Pac I酶切线性化后脂质体法转染293细胞进行包装,扩增,利用绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)监测病毒滴度和感染效率,Western-blot法检测目的蛋白的表达。结果:测序结果显示,pAdTrack-CMV-XC构建成功;PCR及Pac I酶切鉴定结果表明pAd-XC构建成功;经Pac I酶切线性化的pAd-XC转染293细胞后24 h即可观察到GFP的表达;回收的病毒可重复感染293细胞,Western-blot法检测到目的蛋白的表达,证实有感染能力且可表达目的蛋白的病毒颗粒包装成功。结论:HBV X-HCV C融合基因重组腺病毒构建成功,为进一步研究HBV X蛋白和HCV C蛋白的生物学功能奠定了基础。