利用旁侧引物提高重叠延伸PCR定点突变效率

平行模板法简化重叠延伸PCR定点突变流程的思路不能成立,靠近DNA末端的低效限制性酶切才是制约其突变效率的核心原因。故以旁侧引物法提高DNA产物的酶切效率,增加定点突变的成功率。将上、下游引物匹配位点由两侧酶切位点外延50-100 bp,使目标基因两端的酶切位点处于第二轮PCR产物的两端近侧,而非末端。由此提高随后的酶切效率,节省反应时间。由于此时酶切会明显缩短DNA长度,凝胶电泳结果显示仅1 h就完成了对PCR产物的充分酶切。连接产物转化感受态大肠杆菌后形成的克隆数也明显增加,且阳性率由33%-70%提高至100%。经对比检测,旁侧引物法既节省了工作时间,也极大地提高了重叠延伸PCR定点突变过程中的菌落形成数与突变成功率。

重叠延伸PCR技术及其在基因工程上的应用

重叠延伸PCR技术(genesplicingbyoverlapextensionPCR,简称SOEPCR)由于采用具有互补末端的引物,使PCR产物形成了重叠链,从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸,将不同来源的扩增片段重叠拼接起来。此技术利用PCR技术能够在体外进行有效的基因重组,而且不需要内切酶消化和连接酶处理,可利用这一技术很快获得其它依靠限制性内切酶消化的方法难以得到的产物。重叠延伸PCR技术成功的关键是重叠互补引物的设计。重叠延伸PCR在基因的定点突变、融合基因的构建、长片段基因的合成、基因敲除以及目的基因的扩增等方面有其广泛而独特的应用。本文综述了重叠延伸PCR的原理和目前的应用情况,并指出了此技术中的注意事项,展望了其应用前景。

引物悬挂延伸PCR扩增白藜芦醇合酶cDNA

为了得到葡萄白藜芦醇合酶 RS 基因的 c DNA,实验以葡萄叶片为材料 ,利用引物悬挂延伸 PCR法 ,以葡萄总 DNA为模板 ,先分别扩增得到编码白藜芦醇合酶的第一外显子和第二外显子的序列 ,再以这两个序列为模板 ,进行第二轮的 PCR,得到大小与 RS基因大小相同的片段 ,经 PCR产物测序证明 ,两个外显子已经准确无误地拼接 ,此片段就是 RS基因 .

用优化的OE-PCR法构建CⅡTA中间缺失突变体

目的：以构建缺失第109～226位氨基酸密码子的MHCII类分子反式激活因子（MHCclass Ⅱ molecule transactivator，CIITA）突变体为例探索一种简便、稳定的构建中间缺失突变体的方法。方法：首先按照传统重叠延伸PCR方法的原理扩增缺失片段两端的基因片段，再将两片段混合，在不加入外围引物的情况下进行8次PCR循环以有效完成重叠延伸，然后再加入引物进行目的片段指数扩增，将扩增产物直接克隆至真核表达载体pIRES。结果：成功地构建出缺失第109～226位氨基酸密码子的CⅡTA突变体。结论：优化后的重叠延伸PCR法（OE—PCR）克服了传统方法的诸多弊端，非常适合于构建中间缺失突变体，值得推广。

以PCR为基础的定点诱变方法研究进展

以PCR为基础的定点诱变技术是近年来得到极大发展的分子生物学方法,不仅用于基因和蛋白质的结构与功能的基础研究,还用于定点改造目的基因。综述了以PCR为基础的定点诱变的各种方法,并介绍了国内外最新的研究进展,重点介绍并分析了单管大引物法、一步重叠延伸PCR、多位点环状诱变PCR及TAMS定点诱变等新方法,比较了不同方法的优缺点,分析了存在的问题并提出解决对策。

新的有性PCR法

Affymax研究所的Willem Stemmer提出了一种作为产生基因突变体文库并使之经受自然选择压力的技术的“有性聚合酶链反应(Sexual PCR)”法。Stemmer制备了β-内酰胺酶基因突变体并通过有性PCR产生了抗生素抗性水平比原始克隆高16000倍的克隆。 PCR是一系列DNA复制循环,包括三个步骤:使DNA链解离的变性作用、使引物寡核苷酸与解离链杂交的退火、及使引物延伸的聚合作用。复制分子从最初群体开始向下遗传的情况可由分枝树表示,每一分枝点代表在变性步骤中的两链分离。事实上,聚合作用的中断或早熟都会导致错误。

重叠延伸PCR法合成栀子两个糖基转移酶基因

[目的]糖基转移酶UGT94E5和UGT75L6催化栀子果实中西红花总苷生物合成途径的末端步骤。该研究利用重叠延伸PCR法,合成编码这两个酶的基因序列。[方法]首先将基因分段,每段两端均加上p UC57载体的多克隆位点作为接头,拼接成800 bp以下的片段,再输入到DNAWorks软件中,获得最优寡核苷酸片段组合;将合成的寡核苷酸片段混合,用作模板,进行两次PCR扩增,获得加了接头的各段序列,亚克隆到自制的p UC57 T载体上。酶切后回收插入片段,混合,用作模板,扩增全长基因,产物克隆到自制的p UC57 T载体上。[结果]成功合成了栀子Gj UGT9(编码UGT94E5)和Gj UGT1(编码UGT75L6)基因,分别长1 496 bp和1 583 bp。[结论]重叠延伸PCR法能够有效地合成栀子两个糖基转移酶基因序列,为遗传操作奠定了基础。

多片段拼接法克隆人表皮生长因子受体2基因

鉴于从cDNA库中克隆长基因较困难的现实,采取分步扩增与DNA组装相结合的方式,提出一种长基因克隆解决方案。以克隆人表皮生长因子受体2基因为例,先分别扩增出该基因的三个片段F1、F2和F3。通过重叠延伸PCR融合前两个片段得到F12,再利用双片段连接法将F12与F3一起连接插入载体以构建完整基因。从双片段连接物中筛选出上百个菌落,经检测和序列测定,得到一个序列完全准确的克隆。对于难以直接克隆的长基因,可先扩增其各个片段,再将它们拼接成完整基因。其中双片段连接法可突破严格的酶切位点要求对单片段顺序连接的限制,再辅以重叠延伸PCR融合法,即可实现多个基因片段的正确拼接。

嗜线虫致病杆菌Xna基因同源重组载体的构建及遗传转化体系的建立

构建嗜线虫致病杆菌Xna基因的同源重组载体和建立该细菌的遗传转化体系。扩增嗜线虫致病杆菌XNA基因的左右同源片段及质粒PEASY-T1上的卡那抗性基因Km;利用重叠延伸引物PCR法将这3个片段连接起来,然后将其克隆至自杀性载体PJQ200。采用电激法将同源重组载体DNA转化到供体细菌,再利用二亲本结合转移方法将供体细菌中的载体转化到受体细菌CB6菌株。结果成功地扩增了Xna基因的左右同源臂及卡那抗性基因的全长融合片段、构建了Xna基因的同源重组载体,并建立了嗜线虫致病杆菌北京变种的遗传转化体系。

花生白藜芦醇合酶基因cDNA的克隆及植物表达载体的构建

为得到含有白藜芦醇合酶cDNA(RS cDNA)并能表达白藜芦醇(Res)的转基因植物,以花生为材料,从其根部提取基因组DNA,并以其为模板,利用引物悬挂延伸PCR法扩增得到大小约1200bp的片段,将这个片段连接到克隆载体PBS-T上进行测序,测序结果证明,此片段就是花生的RS cDNA。将此片段再正向插入到植物表达载体PBI121的CaMV35s启动子和NOS终止子之间,对重组子进行筛选与鉴定,证明花生的RS cDNA已经正确插入PBI121中,成功的构建了植物表达载体PBI121L。

变性高效液相色谱快速诊断儿童型脊肌萎缩症

目的 建立变性高效液相色谱(denaturinghighperformanceliquidchromatography, DHPLC) 快速诊断儿童型脊肌萎缩症(spinalmuscularatrophy, SMA) 的新方法。方法 (1)用二重聚合酶链反应(PCR) 扩增运动神经元成活基因(survivalmotorneurongene, SMN) 外显子7、8及周围部分内含子序列; (2) 纯化PCR产物以除去其中的引物、dNTP及缓冲液中的盐粒子等成分; (3) 采用多重引物延伸反应特异性检测能将SMN1基因与SMN2基因区分开的3个特异性位点; (4) 将延伸反应的产物用DHPLC在完全变性的条件下分析。结果 将建立的新方法与传统的PCR-酶切法进行盲法对比试验, 检测了30例标本(包含20例SMA患儿和10例正常人群外周血基因组标本) 以验证新方法的特异性和可靠性, 其诊断结果与PCR-酶切法结果完全一致。结论 多重引物延伸反应结合DHPLC分析技术是一种可用于临床SMA基因诊断、产前诊断及胚胎种植前遗传学诊断的高效、灵敏、可靠、快速、简便的新方法。

高羊茅叶绿体表达载体构建及绿色荧光蛋白基因瞬时表达检测

【目的】验证高羊茅叶绿体表达载体在高羊茅叶绿体中的瞬时表达情况,为今后在高羊茅叶绿体中稳定表达该载体,获得耐旱高羊茅的叶绿体转基因株系奠定基础。【方法】首先从高羊茅草叶绿体基因组中克隆16S/trnI-trnA/23S片段,作为定点整合同源片段。然后将耐旱相关基因酵母海藻糖合酶基因tps1与水稻叶绿体16SrRNA基因的强启动子Prrn、烟草叶绿体基因psbA的终止子构建表达盒(Prrn-tps1-TpsbA-ter),连同草丁膦抗性基因bar表达盒、卡那霉素抗性基因nptII和绿色荧光蛋白基因gfp构建的融和基因表达盒一起克隆到定点整合同源片段之间,构建高羊茅叶绿体的稳定表达载体gTKGB。通过基因枪轰击法将gTKGB转化到高羊茅幼嫩叶片中,用激光共聚焦扫描显微镜对GFP的表达情况进行检测分析。【结果】克隆的高羊茅叶绿体基因16S-trnI-trnA-23S在NCBI登录号为:DQ490947-DQ490950。构建的叶绿体表达载体gTKGB转化高羊茅幼嫩叶片,在叶绿体中有很好的GFP表达。【结论】高羊茅叶绿体表达载体gTKGB可用于高羊茅叶绿体转化。

D92P点突变对扩展青霉碱性脂肪酶最适作用温度的改善

利用重叠延伸PCR法对扩展青霉碱性脂肪酶(PEL)基因进行体外定点突变,并构建了含突变基因的重组质粒pPIC3.5K-lip-D92P。将该质粒在毕赤酵母GS115菌株中表达。与野生型表达产物PEL-GS相比较,突变体表达产物PEL-D92P-GS最适作用温度为45℃,比野生型提高了5℃;其热稳定性与野生型相当;突变体在40℃下的表达量为109U/mL,约为野生型的29%。结果分析表明,Pro替代Asp92后,可能是由于Pro一级结构的特点,使酶结构更加稳定,在高温下更适于与底物结合。