Reg Ⅳ基因缺失CRD结构域片段获得及其表达载体的构建与转染

目的:探讨应用基因重叠延伸拼接PCR(SOE-PCR)技术构建Reg Ⅳ基因缺失CRD结构域表达载体,并转染Reg Ⅳ低表达结直肠癌细胞系。方法:应用SOE-PCR法获得Reg Ⅳ缺失CRD结构域片段,构建真核表达载体并转染Reg Ⅳ低表达结直肠癌LoVo细胞,G418筛选,RT-PCR检测鉴定。结果:经酶切鉴定筛选出的重组体测序结果与目的序列完全一致,重组载体构建成功,经pcDNA3.1-Reg Ⅳ-dom ain△转染的LoVo细胞Reg Ⅳ-dom ain△呈阳性表达。结论:利用SOE-PCR技术可成功构建Reg Ⅳ基因缺失CRD结构域的表达载体。

人、黑猩猩和叶猴FKN全基因的克隆及体外表达的比较研究

目的克隆人、黑猩猩和叶猴FKN全基因及体外表达,比较研究FKN在进化过程中基因组水平和蛋白表达水平的差异。方法应用基因重叠延伸拼接PCR法(Gene splicing by overlapping extension PCR,SOE-PCR)将FKN的3个外显子编码序列依次进行前后拼接,然后插入pcDNA3.1/myc-His(-)A真核表达载体中,经酶切、测序鉴定后转染CHO细胞体外表达,RT-PCR、SDS-PAGE和Western blot检测其表达产物。结果酶切、测序鉴定证实插入的基因片段为完整的FKN,RT-PCR可从转染的CHO细胞中扩增出一条与目的基因大小一致的DNA片段,其表达蛋白能分泌至胞外,SDS-PAGE显示其分子量约为95000,抗c-myc抗体可与载体上的c-myc蛋白特异性结合。测序显示人、黑猩猩和叶猴相比,FKN基因除了有散在的点突变外,还发现有一明显的30bp的缺失,但此缺失对FKN蛋白的表达并不影响。结论成功克隆人、黑猩猩和叶猴FKN全基因,基因组水平和蛋白表达水平的比较研究为后续探讨FKN在高级灵长类物种进化过程中免疫学功能的演变奠定基础。

ScFv(3G11)-mms13融合基因克隆及表达载体构建

目的通过重叠延伸拼接PCR(SOE-PCR)技术克隆融合基因ScFv(3G11)-mms13并构建融合蛋白表达载体pET30a(+)-ScFv(3G11)-mms13,为重组制备肿瘤靶向细菌磁小体提供转基因载体。方法根据mms13基因和ScFv(3G11)基因的序列,设计以PCR引物,以克隆载体pMD18-mms13和pMD18-ScFv为模板,采用SOE-PCR技术构建融合基因ScFv-Linker-mms13。进而将融合基因ScFv-mms13与pET30a(+)连接构建重组表达载体pET30a(+)-ScFv-mms13,测序后应用软件DNAMAN进行分析。结果应用重叠延伸拼接PCR方法构建融合基因ScFv-linker-mms13(1158bp),然后通过克隆技术得到重组质粒pMD18-ScFvmms13。将融合基因ScFv-Linker-mms13插入到pET30a(+)构建了重组表达载体pET30a(+)-ScFv-mms13;菌落PCR、酶切、DNA测序鉴定结果均表明目的片段准确地插入到表达载体中。结论通过SOE-PCR技术扩增了预先设计的长达1158bp的融合基因片段ScFv-Linker-mms13,并成功构建了重组质粒pMD18-ScFv-mms13及重组表达载体pET30a(+)-ScFv-mms13,为磁小体用于肿瘤靶向治疗研究提供了实验材料。

丙型肝炎病毒C区和NS3区嵌合基因的克隆及表达

目的获得丙型肝炎病毒(HCV)C-NS3嵌合抗原,以提高HCV酶联免疫吸附试验诊断试剂的质量。方法应用SOE-PCR(拼接重叠延伸PCR)的方法,构建了HCV的C区和NS3区的嵌合基因,克隆于表达载体pGEX-4T3,并转化于大肠杆菌BL21,经筛选,IPTG诱导HCV的C-NS3嵌合抗原的表达。经SDS-PAGE检测表达水平,Western blot检测抗原特异性。结果SOE-PCR构建的HCV C区和NS3区嵌合基因在BL21中获得表达。经鉴定,其相对分子质量约为75000,并具有高度特异性。结论已获得HCV C-NS3嵌合抗原,为提高HCV酶联免疫吸附试验诊断试剂的质量奠定了基础。