蛋白质体外定向进化策略研究进展

定向进化已广泛应用于蛋白质的分子改造,是改善蛋白质特性的最有效策略之一。为了获得更高的突变效率,构建含有更多突变体的文库,不断地发明创新各种高效的蛋白质体外定向进化方法。对近年来出现的几种定向进化方法三核苷酸突变(TriNex)、序列饱和突变(SeSaM)、随机链交换突变法(RAISE)、重叠延伸蛋白域文库法(PDLGO)和迭代饱和突变法(ISM)的原理、特点及应用进行综述。

第60～80位氨基酸多肽片段缺失的HCV核蛋白在真核细胞中的表达

目的:构建丙型肝炎病毒(hepatitisCvirus,HCV)第6080位氨基酸多肽缺失核蛋白的真核表达载体,并在真核细胞中表达.方法:用RTPCR方法从西安地区丙型肝炎患者血清中扩增HCVC区及部分E1区基因并进行克隆、测序,以此为模板用重叠延伸拼接方法扩增第6080位氨基酸多肽基因缺失的核蛋白基因片段(C510),将其定向克隆入哺乳动物高效表达载体pCIneo中,通过Lipofectamine2000转染入p815细胞,经间接免疫荧光染色、激光共聚焦显微镜和WesternBlotting方法检测细胞中目的蛋白的表达.结果:从患者血清中成功克隆出HCVC区基因,序列及系统发生树分析结果显示为1b型;测序结果显示构建的第6080位氨基酸多肽缺失核蛋白基因的重组真核表达质粒pCI510基因序列准确;免疫荧光和免疫印迹方法均证实目的蛋白p170可在p815细胞中表达.结论:重组体pCI510构建正确,其目的基因在p815细胞中可有效表达,为进一步的研究奠定了基础.

D92P点突变对扩展青霉碱性脂肪酶最适作用温度的改善

利用重叠延伸PCR法对扩展青霉碱性脂肪酶(PEL)基因进行体外定点突变,并构建了含突变基因的重组质粒pPIC3.5K-lip-D92P。将该质粒在毕赤酵母GS115菌株中表达。与野生型表达产物PEL-GS相比较,突变体表达产物PEL-D92P-GS最适作用温度为45℃,比野生型提高了5℃;其热稳定性与野生型相当;突变体在40℃下的表达量为109U/mL,约为野生型的29%。结果分析表明,Pro替代Asp92后,可能是由于Pro一级结构的特点,使酶结构更加稳定,在高温下更适于与底物结合。