肠道细菌基因间重复共有序列-聚合酶链式反应指纹图谱技术用于细菌分型的研究进展

肠道细菌基因间重复共有序列-聚合酶链式反应(enterobacterial repetitive intergenic consensus-polymerase chain reaction,ERIC-PCR)指纹图谱技术利用普遍存在于生物体内的ERIC进行引物设计,通过基因扩增,获得能够表征其基因组结构的产物,该方法简单易行、重复性好、用时短,被广泛应用于细菌基因分型及同源性判别。本文简述细菌分型的研究背景和ERIC-PCR指纹图谱技术的原理及特点,归纳该技术在细菌基因分型方面的优缺点及其在常见食源性致病菌基因分型中的应用现状,并对ERIC-PCR指纹图谱技术应用于乳品企业污染菌溯源的研究进行展望。

副溶血性弧菌重复序列-PCR分型研究

利用基因外重复回文序列-PCR(REP-PCR)和肠细菌基因间共有重复序列-PCR(ERIC-PCR)技术,对副溶血性弧菌进行了分子分型研究和亲缘关系的探讨,并使用Hunter和Gaston方法计算分辨力指数。结果显示40株副溶血性弧菌分离株均可扩增产生可重复的DNA指纹图谱,并且不同菌株基因组DNA的扩增条带具有多态性。根据SPSS10.0软件得出的树状图结果,REP-PCR可以把40株菌分为21个型,分辨力指数可达到0.953,优势菌型为G1型;ERIC-PCR可将40株菌分成4个型,分辨力指数为0.5。研究显示重复序列-PCR方法可以用于该菌分型分析,REP-PCR具有较好的分型能力。在两种PCR的DNA指纹图谱中,血清型O1群与O3群主条带均非常相似,表明它们之间亲缘关系密切。

进口蜂蜜中幼虫芽孢杆菌分子分型方法的比较研究

为研究来自不同地域幼虫芽孢杆菌的进化关系,建立其分子分型方法,对来自11个国家和地区的50株幼虫芽孢杆菌分离株进行MLST分型分析,并与ERIC分型比较。结果显示,ERIC法将50株分离株分为ERICⅠ、ERICⅡ与ERICⅣ型,但不能区分不同区域菌株;MLST法将菌株分为ST1至ST8共8种序列型,其中ST1为优势型,占比高且分布广泛;其次为ST5(主要为加拿大分离株),ST3(澳大利亚分离株),ST4(法国与匈牙利分离株),ST6(新西兰分离株),ST2(西班牙分离株),ST7(匈牙利分离株)和ST8(澳大利亚分离株)。与ERIC相比,MLST可以对不同地域的幼虫芽孢杆菌进行有效分型,具有更高的分辨率,可作为后续进口蜂蜜中幼虫芽孢杆菌流行病学调查的工具。

重症监护病区碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌的主动筛查及基因分析

目的调查重症监护病区(ICU)患者在住院期间碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌(CRE)主动筛查菌株的分布以及CRE耐药基因的检测和分析。方法收集424例ICU患者直肠拭子、咽拭子和腹股沟拭子样本,采用肉汤增菌法进行CRE阳性病例的主动筛查,全自动药敏分析仪进行体外药敏试验,PCR法检测碳青霉烯酶耐药基因,通过多位点序列分型(MLST)和肠杆菌基因间重复共有序列PCR分析CRE菌株的同源性关系。结果直肠拭子、咽拭子和腹股沟拭子CRE筛查阳性率分别为12.5%、5.0%和4.2%,CRE菌株主要来自肺炎克雷伯菌(82.6%)、大肠埃希菌(9.8%)和产气肠杆菌(4.3%),CRE菌株对替加环素、头孢他啶阿维巴坦敏感性较好(>90%);92株CRE碳青霉类耐药基因检测,以blaKPC-2亚型(91.3%)为主;MLST分型结果显示76株碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌(CRKP)主要为ST11型(69.7%)和ST15型(28.9%);ERIC-PCR扩增结果分析显示,76株肺炎克雷伯菌主要为谱型A(69.7%)和谱型B(28.9%)。结论ICU住院患者CRE主动筛查以blaKPC-2亚型的CRKP为主,MLST分型和ERIC-PCR扩增结果聚类分析发现主要存在两个克隆株传播。

肉鸡生产链中肠炎沙门氏菌耐药性分析及ERIC-PCR分型

目的：了解肉鸡生产链中肠炎沙门氏菌耐药性情况以及各生产环节菌株间亲缘关系,为临床用药及菌株追踪溯源提供依据。方法：采用微量肉汤稀释法对171株肠炎沙门氏菌进行13种抗菌药物药敏实验;采用肠杆菌基因间重复共有序列-聚合酶链式反应（enterobacterial repetitive intergenic consensus-polymerase chain reaction,ERIC-PCR）法对33株不同生产环节耐药菌株进行分子分型;采用SPSS 20.0软件、Gel-Pro Analyer 4.0和NTSYS pc 2.1软件进行分析。结果：171株肠炎沙门氏菌对13种药物耐药情况不同,其中对氨苄西林耐药情况最严重,耐药率高达90.06%,对恩诺沙星、氧氟沙星最为敏感,耐药率均仅为5.26%;不同环节间耐药性差异极显著（P〈0.01）;多重耐药率高达95.32%,共有26种耐药谱型。不同环节的33株肠炎沙门氏菌分为4种（Ⅰ~Ⅳ）基因型,遗传相似性在66%~100%,Ⅰ型为优势基因型;基因型相同的菌株耐药谱不一定相同,反之,耐药谱相同的菌株基因型不一定相同。结论：肉鸡生产链条中沙门氏菌对多种抗菌药物产生耐药性,且耐药谱种类繁多;沙门氏菌能够沿着生产链进行水平传播,肉鸡场环节菌株基因型相对复杂,菌株基因型与耐药表型之间无明显相关性。

大蒜多糖对急性酒精性肝损伤小鼠肠道菌群失调的影响

应用肠杆菌基因间重复共有序列基因扩增(enterobacterial repetitive intergenic consensus-polymerase chain reaction,ERIC-PCR)和聚合酶链式反应--变性梯度凝胶电泳(polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis,PCR-DGGE)研究大蒜多糖对急性酒精性肝损伤小鼠肠道菌群失调的影响。灌胃红星二锅头建立小鼠急性酒精性肝损伤模型,ERIC-PCR和PCR-DGGE电泳获得肠道菌群指纹图谱,分析肠道菌群的相似性和多样性并鉴定优势条带序列。ERIC-PCR结果表明急性酒精性肝损伤模型小鼠肠道菌群结构发生明显改变,以360 bp的条带为优势条带,610 bp左右的条带强度减弱,大蒜多糖预防给药组中360 bp左右的条带强度减弱。PCR-DGGE结果显示急性酒精性肝损伤的小鼠肠道菌群多样性指数降低,优杆菌属和乳酸菌属细菌明显减少。大蒜多糖高剂量组的多样性指数和均匀度指数最高,优杆菌属和乳酸菌属细菌增多。大蒜多糖可以促进肠道中优杆菌属和乳酸菌属生长,调节急性酒精性肝损伤伴有的肠道菌群失调。

UC和其它肠道疾病肠道菌丛结构的ERIC-PCR指纹图谱分析

目的建立溃疡性结肠炎(UC)和其它肠道疾病的肠道细菌DNA指纹图谱以分析其肠道菌丛的整体差异。方法采集19例UC、11例急性胃肠炎、6例IBS患者及11例正常对照者的粪便标本,提取肠道细菌总DNA;应用ERIC-PCR技术建立各组肠道细菌DNA指纹图谱,分析UC、急性胃肠炎、IBS患者及正常对照者的肠道菌丛的整体差异。结果经分析发现四组研究对象的肠道菌丛存在整体差异:UC组ERIC-PCR指纹图谱电泳DNA条带较少,IBS组、急性胃肠炎组和正常对照组ERIC-PCR指纹图谱电泳DNA条带多;UC组中有18个样本主带分布非常一致,均出现在约0.7 kb处,急性胃肠炎组主带分布也非常一致,均出现在约1.1 kb和0.8 kb处;正常对照组和IBS组主带位置无统一趋势。结论与IBS、急性胃肠炎和正常对照组相比较,UC组肠道优势菌群种类少;UC组和急性胃肠炎组各有分布较一致的主带;UC可能存在较单一的肠道优势细菌,推测其发病机制可能与特定的肠道优势细菌感染有关。

2型糖尿病患者肠道菌群两种分子指纹图谱分析研究

目的：利用重复共有序列（ERIC）和变性梯度凝胶电泳（DGGE）两种分子指纹图谱技术对2型糖尿病患者肠道菌群结构特征分析，探讨2型糖尿病与肠道菌群的相关性及对两种方法的评价。方法收集8例健康人和7例2型糖尿病患者粪便样本，提取粪便菌群总 DNA，采用 ERIC-PCR 和 DGGE-PCR 分子指纹图谱技术对两组人群肠道菌群结构分析，比较其多样性、相似性等生态学特征。结果与健康对照组比较，2型糖尿病患者肠道菌群图谱条带和 Shannon-Wiener 多样性指数降低，但无统计学意义；组内相似性降低差异有统计学意义（P ＜0.05），菌群结构发生变化；两种指纹图谱技术均能直观反映肠道菌群结构特征，ERIC 方法简便，反映菌群多样性良好，但是实验影响因素较多，不可切胶测序；DGGE 能较好反映菌群多样性、相似性等生态学特征，而且可选择条带切胶测序。结论2型糖尿病患者肠道菌群组成结构发生改变，糖尿病的发生与肠道菌群有一定相关性；ERIC 和 DGGE 是研究肠道菌群分辨效率高、重复性好的指纹图谱技术， DGGE 并可进行切胶测序比对鉴定细菌，二者可结合使用。

慢传输便秘大鼠肠道菌群的ERIC-PCR指纹图谱分析

目的应用细菌基因共有重复序列指纹图谱技术,探讨慢传输便秘肠道菌群的变化。方法选取Wistar大鼠30只,随机分为对照组15只、造模组15只,造模组给予易蒙停灌胃。收集每24 h排出粪便,计数排便粒数,称量粪便质量,及24 h进食量及进水量,通过碳末灌胃测定肠道传输时间。留取造模组与对照组不同时段粪便,提取肠道细菌DNA,进行ERIC-PCR指纹图谱分析。结果造模组大鼠24 h内排便粒数、排便质量、进食量较对照组明显减少,进水量没有明显差异。造模组大鼠肠道传输时间明显高于对照组。造模组大鼠肠道菌群ERIC-PCR结果优势条带依然存在,但是较对照组及给药前条带增多且亮度增高。结论易蒙停给药致慢传输便秘大鼠造模成功,造模组大鼠肠道菌群较对照组ERIC-PCR结果可能存在细菌数量及种类增多。

铜绿假单胞菌临床感染特征及其产超广谱β-内酰胺酶危险因素分析

目的探讨郑州市2家医院临床分离铜绿假单胞菌的感染特征及其与产生超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)的关系。方法选取2016年1月至2017年8月郑州市2家医院临床标本中分离出的51株非克隆铜绿假单胞菌,采用K-B纸片扩散法筛选出产ESBLs铜绿假单胞菌,采用肠杆菌基因间重复共有序列(ERIC)-聚合酶链反应(PCR)对51株铜绿假单胞菌株进行同源性分析,采用单因素和Logistic回归分析探讨铜绿假单胞菌产ESBLs的危险因素。结果51株铜绿假单胞菌共检测出产ESBLs菌株22株,产ESBLs菌株阳性率为43.1%。51株铜绿假单胞菌ERIC-PCR同源性分析显示I型29株,Ⅱ型17株,Ⅲ型5株。单因素分析显示,内科来源的菌株中产ESBLs阳性菌株所占比例(59.2%)显著高于ICU来源的菌株(20.0%)(P<0.05),ERIC-PCR分型I型菌株产ESBLs阳性率(55.2%)显著高于Ⅱ型菌株(23.5%)及Ⅱ、Ⅲ型菌株之和(27.3%)(P<0.05)。Logistic多因素分析显示,ERIC-PCR分型I型、内科来源菌株为铜绿假单胞菌产ESBLs的危险因素(P<0.05)。结论郑州地区铜绿假单胞菌感染以内科多见,性别分布上以男性患者为主,同源性分析以Ⅰ型和Ⅱ型为主,内科来源及ERIC-PCR分型Ⅰ型菌株是郑州地区医院内铜绿假单胞菌产生ESBLs的危险因素。

2型糖尿病合并急性胰腺炎大鼠肠道微生物ERIC-PCR指纹图谱的分析

目的应用肠杆菌基因间重复共有序列-聚合酶链式反应(enterobacteria repetitive intergenic consen sussequencespolymerase chain reaction,ERIC-PCR)技术检测2型糖尿病合并急性胰腺炎后大鼠肠道内菌群的数量及多样性的改变情况。方法40只10周龄雄性大鼠,其中20只Wistar大鼠,随机分为空白对照组(QB组)、单纯急性胰腺炎大鼠模型(AP组);20只Goto-kakisaki自发性2型糖尿病大鼠(GK大鼠)随机分为2型糖尿病组(DM组)、2型糖尿病合并急性胰腺炎组(DAP组);每组10只,分别标号。其中AP组、DAP组作为造模组。检测DAP组和AP组24 h血清胰淀粉酶活性水平和随机血糖。48 h后:(1)处死各组大鼠,取胰腺观察病理损伤程度并以改良Schmidt法为标准进行胰腺组织病理评分。(2)采集各组大鼠新鲜粪便,并提取新鲜大鼠粪便基因组,进行基因组扩增,将PCR产物点样于琼脂糖凝胶,制作目的 ERIC-PCR指纹图谱;(3)同时将采集的新鲜粪便处理后制成不同浓度梯度细菌悬浊液,接种于BBL琼脂培养基、MRS肉汤培养基、SS琼脂培养基、MAC琼脂培养基上培养并计数。结果 (1)AP组、DAP组病死率分别是20%(2/10)和40%(4/10),QB组、DM组无死亡,DAP组病理评分最高;(2)DAP组术后24 h血糖水平较AP组升高,差异具有统计学意义(t=2.24,P<0.05);DAP组术后24 h血淀粉酶较AP组无明显变化,两组比较差异无统计学意义(t=6.40,P=0.53);(3)肠道菌群多样性指数、ERIC-PCR指纹图谱及相似性聚类分析显示,DAP组特征性条带数量减少且肠道菌群多样性改变;(4)4组间肠道微生物菌群比较,差异具有统计学意义。进一步两两比较,DAP组的双歧杆菌和乳酸杆菌低于QB组和AP组,差异具有统计学意义(P<0.05);DAP组的大肠杆菌和变形杆菌高于QB组和AP组,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论 (1)2型糖尿病大鼠并发急性胰腺炎后肠道菌群的结构均发生改变,菌群多样性减少;益生菌减少及条件致病菌增多;(2)肠道菌群的变化参与2型糖尿病合并急性胰腺炎的病程进展。

猕猴肠道菌群基因组DNA提取及其ERIC-PCR分析

本试验采用反复冻融法、酶裂解法和试剂盒法分别提取猕猴肠道菌群的总DNA,根据提取的DNA浓度和纯度最终确定酶裂解法为较好的方法。将酶裂解法提取的DNA进行ERIC-PCR扩增,结果显示:同年龄组猕猴粪样的ERIC条带数量和位置变化不大;幼年组猕猴的菌群种类较丰富,但优势菌群不明显;青年组猕猴的菌群种类和优势菌群最为丰富;老年组猕猴的菌群种类最少。

南方食品中沙门氏菌污染调查及分型

【目的】系统调查我国南方代表性地区食品中沙门氏菌污染情况,并对分离株进行血清分型和肠杆菌基因间重复共有序列聚合酶链式反应(Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus Polymerase Chain Reaction,ERIC-PCR)分型研究,为溯源和控制食品中沙门氏菌的污染提供数据。【方法】采用定性法和最大可能数(Most Probable Number,MPN)法对七大类食品(肉与肉制品、水产品、速冻食品、熟食、蔬菜、乳制品和食用菌)中的沙门氏菌进行检测。利用血清分型和分子分型确定南方沙门氏菌血清型的分布和优势血清型,研究分离株的遗传多样性。【结果】从400份食品样品共检出75份沙门氏菌阳性样品,污染率为18.8%(75/400)。其中,97.3%(73/75)的阳性样品污染水平均低于10 MPN/g。对93株分离株进行血清分型,分属9个群、29种血清型。优势血清型为德尔卑沙门氏菌(Salmonella Derby)和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella Typhimurium)。利用ERIC-PCR对96株沙门氏菌(包括93株分离株和3株标准株)进行分型研究发现,在相似系数为0.75时可分为15个聚类簇,56种型别,分离株的基因型别呈现多样性。【结论】南方食品中沙门氏菌的污染率较高,但污染水平低。S.Derby和S.Typhimurium为优势血清型。初步建立了沙门氏菌ERIC-PCR指纹图谱数据库,南方食品中沙门氏菌的血清型和基因型呈现多样性。

海产品中沙门氏菌的分离及其ERIC-PCR指纹分析

目的了解常见市售鲜活海产品沙门氏菌污染情况及不同菌株间遗传相似性,为沙门氏菌的流行病学研究提供有价值的信息。方法采集市售常见海鱼、贝类和蟹等海产品,按照常规方法分离沙门氏菌,分析分离菌的ERIC-PCR DNA指纹图谱。结果共检查191份样品,从42份中分离到沙门氏菌45株。ERIC-PCR DNA指纹图谱分析,45株分离菌被分为两个大的分支,遗传相似性在50%~100%之间。结论市售海产品有沙门菌污染,同一种海产品污染菌的基因型可有不同,不同海产品之间也存在相同基因型沙门氏菌株污染。

高校学生宿舍室内空气中产超广谱β-内酰胺酶大肠埃希菌分离株ERIC-PCR指纹图谱分析

【目的】了解大学生宿舍空气中产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)大肠埃希菌的检出率和分离株之间的遗传相似性,为预防和控制传染病的传播提供依据。【方法】用FA-1型六级筛孔撞击式空气微生物采样器采集大学生宿舍内室内空气并分离鉴定其中的产ESBLs大肠埃希菌,采用ERIC-PCR扩增基因组DNA,形成聚类图谱,分析分离株的相似性。【结果】从收集到的300份空气样品中分离鉴定出194株大肠埃希菌,30株鉴定为超广谱β-内酰胺酶分离株,检出率达15.46%;产ESBLs大肠埃希菌ERIC-PCR指纹图谱条带相似性在50%100%之间。【结论】大学生宿舍空气中存在着产ESBLs大肠埃希菌污染,应加强对空气中大肠埃希菌耐药性监测。

奇异变形杆菌临床分离株的药敏分析及ERIC-PCR分型

目的了解奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)耐药性情况及菌株间亲缘关系,为临床用药及菌株追踪溯源提供依据。方法收集医院2011年-2015年部分临床标本中分离、鉴定的77株奇异变形杆菌,采用药敏纸片扩散法进行20种抗菌药物药敏试验,并采用肠杆菌基因间重复共有序列-聚合酶链式反应(enterobacterial repetitive intergenic consensus-polymerase chain reaction,ERIC-PCR)法对77株耐药菌株进行分子分型。结果检测的20种抗菌药物中,奇异变形杆菌对红霉素耐药情况最严重,耐药率为97.40%,对头孢西丁和头孢吡肟最为敏感,耐药率均仅为2.60%和7.79%;77株奇异变形杆菌可划分为16(I^XVI)个基因簇,54株菌株相似性>70%。结论奇异变形杆菌临床分离株对多种抗菌药物产生耐药性,且耐药谱种类繁多。从分型结果得出,奇异变形杆菌菌株基因型相对多样,菌株基因型与耐药表型之间无明显相关性。