【目的】利用P2C可以定向进入卵巢以及Gal4蛋白可与UAS序列稳定结合的特点,在中华按蚊Anopheles sinensis中建立高效的非胚胎期外源DNA投递技术系统。【方法】注射P2C-Gal4-DsRed重组蛋白至吸血后20 h时的中华按蚊雌成蚊腹部,通过冰冻...【目的】利用P2C可以定向进入卵巢以及Gal4蛋白可与UAS序列稳定结合的特点,在中华按蚊Anopheles sinensis中建立高效的非胚胎期外源DNA投递技术系统。【方法】注射P2C-Gal4-DsRed重组蛋白至吸血后20 h时的中华按蚊雌成蚊腹部,通过冰冻切片荧光观察和Western blot检测分析重组蛋白P2C-Gal4-DsRed在卵巢中的投递效率;制备P2C-Gal4 DNA BINDING重组蛋白,构建包含12×UAS重复基序的转基因质粒和辅助质粒,通过电泳迁移实验分析重组蛋白P2C-Gal4 DNA BINDING和12×UAS重复基序间的体外结合;分别将体外孵育的P2C-Gal4 DNA BINDING+辅助质粒ITF36-12×UAS和P2C-Gal4 DNA BINDING+转基因质粒ITF2-12×UAS afm复合物注射入吸血后20 h时的中华按蚊雌成蚊腹部,于血餐后40 h时提取其卵巢组织DNA,并通过特异性引物PCR扩增和测序分析外源DNA在活体中的投递情况。【结果】100%注射P2C-Gal4-DsRed的中华按蚊雌成蚊卵巢在绿色滤光片下呈现明显的红色荧光,表明P2C-Gal4-DsRed重组蛋白能够被高效地导入雌成蚊卵巢中;P2C-Gal4 DNA BINDING重组蛋白能够与12×UAS重复基序以及含有该重复基序片段的质粒稳定结合;分别有91%和93%的注射了P2C-Gal4 DNA BINDING+ITF36-12×UAS和P2C-Gal4 DNA BINDING+ITF2-12×UAS afm的雌成蚊卵巢组织中能够检测到外源DNA片段。【结论】在中华按蚊中成功建立了基于P2C卵巢导向肽和Gal4-12×UAS重复基序结合特性的外源DNA投递技术体系;通过此技术平台能够便捷、快速和高效地实现质粒等DNA分子在中华按蚊卵巢中的投递,这为进一步简化转基因、过表达及基因敲入等遗传操作奠定了基础。展开更多
目的探讨FKBP51·PHLPP·Akt信号模块对大鼠脑缺血/再灌注(I/R)后Akt磷酸化及海马CAl区迟发性神经元损伤的影响。方法采用Pulsinelli-Brierley法制作全脑缺血损伤模型,每亚组6只动物,缺血前连续3d侧脑室注射PH结构域且富...目的探讨FKBP51·PHLPP·Akt信号模块对大鼠脑缺血/再灌注(I/R)后Akt磷酸化及海马CAl区迟发性神经元损伤的影响。方法采用Pulsinelli-Brierley法制作全脑缺血损伤模型,每亚组6只动物,缺血前连续3d侧脑室注射PH结构域且富含亮氨酸重复基序的丝/苏氨酸蛋白磷酸酶2(PHdo.mainand Leucinerichrepeat Protein Phosphatases,PHLPP2)反义寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotides,ASODN)后缺血15rain,再灌注6h,应用免疫共沉淀及免疫印记分别检测PHLPP2、FK506连接蛋白5(FK506bindingprotein5,FKBP51)和蛋白激酶B(ProteinkinaseB,Akt)三者两两结合、检测Akt及其磷酸化的表达情况。再灌注5d,断头取脑,石蜡切片,苏木精一伊红染色,图像分析测定单位面积内染色细胞面积总和。I/R+ASODN组分别与I/R组及I/R+错义寡核苷酸(missense0ligodeoxynucleotides,MSODN)组比较,进行统计学分析。结果单因素方差分析结果显示:与I/R+PHLPP2MSODN组(1.24+0.24)比较,I/R+PHLPP2ASODN组(1.06±0.01)PHLPP2与Akt间的两两结合水平明显受到抑制(P〈0.05);与I/R+PHLPP2MSODN组(1.68±0.11)比较,I/R+PHLPP2ASODN组(1.04±0.13)FKBP51与Akt间的两两结合水平明显受到抑制(P〈0.05);与I/R+PHLPP2MSODN组(0.58±0.01)比较,I/R+PHLPP2ASODN组(0.76±0.02),P-Akt表达水平明显增加(P〈0.05),而Akt总蛋白表达无明显变化(P〉0.05);I/R5d+PHLPP2ASODN组[(88-3±2.7)个]与I/R+PHLPP2MSODN组[(20.1±2.5)个]比较,差异有统计学意义(P〈0.05)。结论FKBP51·PHLPP·Akt模块可能通过Akt信号通路参与脑缺血再灌注损伤,促进海马CAl区神经元的迟发性损伤。展开更多
文摘【目的】利用P2C可以定向进入卵巢以及Gal4蛋白可与UAS序列稳定结合的特点,在中华按蚊Anopheles sinensis中建立高效的非胚胎期外源DNA投递技术系统。【方法】注射P2C-Gal4-DsRed重组蛋白至吸血后20 h时的中华按蚊雌成蚊腹部,通过冰冻切片荧光观察和Western blot检测分析重组蛋白P2C-Gal4-DsRed在卵巢中的投递效率;制备P2C-Gal4 DNA BINDING重组蛋白,构建包含12×UAS重复基序的转基因质粒和辅助质粒,通过电泳迁移实验分析重组蛋白P2C-Gal4 DNA BINDING和12×UAS重复基序间的体外结合;分别将体外孵育的P2C-Gal4 DNA BINDING+辅助质粒ITF36-12×UAS和P2C-Gal4 DNA BINDING+转基因质粒ITF2-12×UAS afm复合物注射入吸血后20 h时的中华按蚊雌成蚊腹部,于血餐后40 h时提取其卵巢组织DNA,并通过特异性引物PCR扩增和测序分析外源DNA在活体中的投递情况。【结果】100%注射P2C-Gal4-DsRed的中华按蚊雌成蚊卵巢在绿色滤光片下呈现明显的红色荧光,表明P2C-Gal4-DsRed重组蛋白能够被高效地导入雌成蚊卵巢中;P2C-Gal4 DNA BINDING重组蛋白能够与12×UAS重复基序以及含有该重复基序片段的质粒稳定结合;分别有91%和93%的注射了P2C-Gal4 DNA BINDING+ITF36-12×UAS和P2C-Gal4 DNA BINDING+ITF2-12×UAS afm的雌成蚊卵巢组织中能够检测到外源DNA片段。【结论】在中华按蚊中成功建立了基于P2C卵巢导向肽和Gal4-12×UAS重复基序结合特性的外源DNA投递技术体系;通过此技术平台能够便捷、快速和高效地实现质粒等DNA分子在中华按蚊卵巢中的投递,这为进一步简化转基因、过表达及基因敲入等遗传操作奠定了基础。
文摘目的探讨FKBP51·PHLPP·Akt信号模块对大鼠脑缺血/再灌注(I/R)后Akt磷酸化及海马CAl区迟发性神经元损伤的影响。方法采用Pulsinelli-Brierley法制作全脑缺血损伤模型,每亚组6只动物,缺血前连续3d侧脑室注射PH结构域且富含亮氨酸重复基序的丝/苏氨酸蛋白磷酸酶2(PHdo.mainand Leucinerichrepeat Protein Phosphatases,PHLPP2)反义寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotides,ASODN)后缺血15rain,再灌注6h,应用免疫共沉淀及免疫印记分别检测PHLPP2、FK506连接蛋白5(FK506bindingprotein5,FKBP51)和蛋白激酶B(ProteinkinaseB,Akt)三者两两结合、检测Akt及其磷酸化的表达情况。再灌注5d,断头取脑,石蜡切片,苏木精一伊红染色,图像分析测定单位面积内染色细胞面积总和。I/R+ASODN组分别与I/R组及I/R+错义寡核苷酸(missense0ligodeoxynucleotides,MSODN)组比较,进行统计学分析。结果单因素方差分析结果显示:与I/R+PHLPP2MSODN组(1.24+0.24)比较,I/R+PHLPP2ASODN组(1.06±0.01)PHLPP2与Akt间的两两结合水平明显受到抑制(P〈0.05);与I/R+PHLPP2MSODN组(1.68±0.11)比较,I/R+PHLPP2ASODN组(1.04±0.13)FKBP51与Akt间的两两结合水平明显受到抑制(P〈0.05);与I/R+PHLPP2MSODN组(0.58±0.01)比较,I/R+PHLPP2ASODN组(0.76±0.02),P-Akt表达水平明显增加(P〈0.05),而Akt总蛋白表达无明显变化(P〉0.05);I/R5d+PHLPP2ASODN组[(88-3±2.7)个]与I/R+PHLPP2MSODN组[(20.1±2.5)个]比较,差异有统计学意义(P〈0.05)。结论FKBP51·PHLPP·Akt模块可能通过Akt信号通路参与脑缺血再灌注损伤,促进海马CAl区神经元的迟发性损伤。