蛋白质的氧化重折叠

经过近几十年来广泛而深入的研究 ,蛋白质氧化重折叠的机制已得到相当详细的阐明。 1 在已研究过的蛋白质中 ,大多数蛋白质都是沿着多途径而非单一、特定的途径进行氧化重折叠 ,这与折叠能量景观学说是一致的。 2 正是氨基酸残基间的天然相互作用而不是非天然的相互作用控制蛋白质的折叠过程。这一结论与含非天然二硫键的折叠中间体在牛胰蛋白酶抑制剂 (BPTI)折叠中所起的重要作用并非相互排斥 ,因为后者仅仅是进行链内二硫键重排的化学反应所必需 ,与控制肽链折叠无直接关系。 3 根据对BPTI的研究 ,二硫键曾被认为仅仅具有稳定蛋白质天然结构的作用 ,既不决定折叠途径也不决定其三维构象。这一观点不适用于其它蛋白质。对凝乳酶原的研究表明 ,天然二硫键的形成是恢复天然构象的前提。天然二硫键的形成与肽键的正确折叠相辅相成 ,更具有普遍意义。 4 在氧化重折叠的早期 ,二硫键的形成基本上是一个随机过程 ,随着肽链的折叠二硫键的形成越来越受折叠中间体构象的限制。提高重组蛋白质的复性产率是生物技术领域中的一个巨大的挑战。除了分子聚集外 ,在折叠过程中所形成的二硫键错配分子是导致低复性率的另一个主要原因。氧化重折叠机制的阐明为解决此问题提供了有益的启示。如上所述 ,在折叠的后期 。

伸展态β-乳球蛋白重折叠过程的动力学特性

从蛋白质变性的渐变模型及构象态渐变的观点出发 ,对伸展态 β -乳球蛋白的重折叠过程进行了分析 ,发现蛋白质分子从伸展态到最终折叠态历经一系列中间稳定态 .尿素浓度梯度电泳实验结果显示 ,存在两条不同的折叠途径 .在不同的尿素浓度范围内 。

盐酸胍诱导的变性卵清溶菌酶分子重折叠过程及其各稳定构象态的分布和过渡

采用变性和非变性电泳、高效凝胶排阻色谱、内源荧光发射光谱和荧光相图以及生物活性测定等方法,研究了盐酸胍诱导的变性卵清溶菌酶分子的重折叠过程及此过程中卵清溶菌酶分子各稳定构象态的分布和过渡.结果表明,当复性液中盐酸胍浓度分别约为5.0和2.4 mol/L时,变性卵清溶菌酶分子的重折叠过程各存在1个稳定折叠中间态,重折叠过程符合'四态模型'.在卵清溶菌酶分子四态重折叠过程基础上,结合盐酸胍与卵清溶菌酶分子之间的缔合-解离平衡,给出了一个定量描述变性剂诱导的蛋白质分子复性过程中蛋白质分子复性率随溶液中变性剂浓度变化的方程.该方程包含2个特征折叠参数,一个是蛋白质分子从一个稳定构象态过渡到另一个稳定构象态的热力学过渡平衡常数k;另一个是在此过程中平均每个蛋白质分子所结合的变性剂分子数目m.通过这2个特征折叠参数能够定量描述盐酸胍诱导的变性卵清溶菌酶完全去折叠态、折叠中间态和天然态分子随复性液中盐酸胍浓度变化的分布和过渡情况.

多方法组合分析脲诱导的淀粉液化芽孢杆菌α-淀粉酶去折叠和重折叠过程的构象转化

以变性和非变性电泳、体积排阻色谱、内源荧光发射光谱、荧光相图、荧光猝灭以及活性测定等组合分析方法,研究了脲诱导的淀粉液化芽孢杆菌α-淀粉酶分子的去折叠和重折叠过程。结果表明,在脲诱导的芽孢杆菌α-淀粉酶分子的去折叠和重折叠过程中,芽孢杆菌α-淀粉酶分子始终以单分子形式存在,不会形成分子间的聚集体或聚集体沉淀。当变性液或复性液中脲浓度约为4.0mol/L时,芽孢杆菌α-淀粉酶分子的去折叠和重折叠过程中均出现一个部分折叠中间体,两个过程均符合"三态模型"。脲诱导的芽孢杆菌α-淀粉酶分子重折叠过程的复性曲线几乎与芽孢杆菌α-淀粉酶分子去折叠过程的残余活性率曲线重合。通过这些结果,并结合盐酸胍诱导的芽孢杆菌α-淀粉酶分子的去折叠和重折叠过程,推断脲和盐酸胍诱导的芽孢杆菌α-淀粉酶分子的去折叠和重折叠过程分别是相互可逆的。

三种抗人TNF-α重组抗体的重折叠

目的 探讨重组抗体蛋白的复性规律 .方法 用共溶剂氧化还原、表面活性剂介导、变性剂介导及抗原介导复性四种条件对抗人 TNF- α单域抗体、单链抗体 GST融合蛋白进行了分离纯化 .结果 复性产物的可溶率为 1 0 %左右 .结论 几种复性方法均可使目的蛋白复性 。

椰子花粉过敏原profilin蛋白体外重折叠过程的光谱学研究

在基因工程技术中,采用原核表达系统获得的重组蛋白通常都是以包涵体的形式存在。利用圆二色性光谱、荧光光谱和同步荧光光谱对尿素诱导的重组椰子花粉泛过敏原profilin蛋白包涵体的复性过程进行了系统的光谱学研究,得到了profilin蛋白复性过程的光谱学特征;结合生物信息学方法,通过对profilin蛋白的二级结构和三级结构的预测,进一步分析了复性过程中profilin蛋白构象变化的特点,初步建立了一种新的检测重组变应原蛋白复性程度的光谱学实验方法,为重组蛋白包涵体复性机理的深入研究进行了有益的探索。

不同因素对人Ⅹ型磷脂酶A2包涵体重折叠的影响

人Ⅹ型磷脂酶A2 在大肠杆菌中的表达产物完全以不溶的包涵体形式存在. 用以前适用于人胰型(IB 型) 磷脂酶A2 的稀释重折叠方法,并不能使它有效重折叠. 以初步纯化的包涵体为对象,发现溶液的温度、pH 值和蛋白质浓度对Ⅹ型磷脂酶A2 体外重折叠有很大的影响. 研究了一些小分子化合物对Ⅹ型磷脂酶A2 ,在高蛋白质浓度(1 g/L)下重折叠的影响,发现1 mol/L 的L-精氨酸能提高其重折叠效率达6倍多. L-精氨酸的结构类似物L-瓜氨酸对Ⅹ型磷脂酶A2 的重折叠有较弱的改善,而L-赖氨酸和L-精氨酸甲基酯则降低了Ⅹ型磷脂酶A2 的活性恢复. 结果表明,L-精氨酸对蛋白质重折叠的帮助作用,可能是通过精氨酸与折叠中间物的结合产生的,精氨酸的胍基和羧基都是必需的,其侧链胍基以其特殊的带电方式阻遏了重折叠过程中的积聚和分子间二硫键形成的反应.

TRAIL包涵体在细胞内重折叠现象的初步研究

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(Apo2L/TRAIL)是一种新型的抗肿瘤蛋白。但在大肠杆菌表达系统中,表达的TRAIL蛋白往往容易聚集形成包涵体。本文对重组TRAIL包涵体在胞内重折叠转化成可溶性TRAIL蛋白作了初步探索,结果表明:当蛋白表达后,迅速降低温度至30℃并添加50μg/mL氯霉素继续培养4 h,可溶性TRAIL产量可提高至16.7%。这一结果在3.7L罐上也得到了证实,可溶性TRAIL表达量达到14.5%。

B36-12 重组人可溶性Fas配基在大肠杆菌中的表达、纯化、重折叠和表征Sun KH等

Fas配基(FasL)是一种Ⅱ型膜蛋白，通过基质金属蛋白酶切割可获得具生物学活性的可溶性形式(sFasL)。sFasL会诱导耐Fas细胞的凋亡，而这一特殊的生物学活性也许可用于癌症治疗。然而，蛋白的三聚体形式使重组sFasL很难获得。本研究将sFasL DNA融合在硫氧还蛋白基因的氨基端，在羧基端加上His标签，在大肠杆菌中过表达。为了限制后继重折叠过程的自由度，将重组sFasL溶于6mol／L尿素，在变性条件下固定于镍树脂。通过逐步稀释法将固定的重组sFasL与过量的变性sFasL共同温育进行重折叠。

重组人粒细胞刺激因子蛋白特性及蛋白重折叠过程杂质研究

重组人粒细胞刺激因子(rhG-CSF)是用于治疗化疗所致的中性粒细胞减少症。来源于基因工程的细胞表达的包涵体,包涵体经过变性、复性和分离纯化等步骤处理后得到药用级别的rhG-CSF。本文根据重组人粒细胞刺激因子蛋白结构特性,对包涵体裂解复性过程中蛋白质重折叠过程进行总结,通过对其重折叠过程的研究,以便于找寻到更优化裂解复性条件,提高下游生产回收率,提高工业生产效益。

结肠平滑肌双重折叠成形术

结肠平滑肌双重折叠SMFD)成形术是替代内括约肌加强排便控制的一种有效方法,在治疗肛门直肠畸形施行拖出术时,应作为一个附加的常规手术.为了能更广泛地使用于二期手术者(由于原手术部位和提肛肌区域有大量疤痕,以及结肠较短,作典型sMFD成形术有困难),作者提出改良的'门翼状',(Door-Wmg)SMFD成形术,此法可以避免再游离结肠,只须在结肠最低位将肌层切开,并与其后粘膜游离,作折叠成形(附图).

pH偏移处理对猪肝蛋白乳化特性的影响

为探究猪肝蛋白(porcine liver protein,PLP)的pH偏移诱导重折叠改性方法与机制。猪肝蛋白溶液经pH偏移处理(pH3~11)后再将pH值调整到中性,经过冻干处理后再测定改性猪肝蛋白的溶解度、乳化活性与稳定性、表面疏水性、乳液粒径与Zeta电位、活性巯基及内源荧光光谱、红外光谱。结果表明,在pH酸性偏移条件下,PLP的溶解度、乳化活性及乳化稳定性均有所下降,乳液粒径增大、Zeta电位绝对值下降,而pH碱性偏移处理会使PLP的溶解度和乳化活性、乳化稳定性提高,乳液粒径减小、Zeta电位绝对值上升;改性后PLP的荧光强度及活性巯基含量降低,表明pH偏移处理对蛋白质三级结构产生显著影响,而根据红外光谱结果显示,其对蛋白质二级结构影响较小。因此,pH碱性偏移处理可作为提高猪肝蛋白的乳化性、溶解性等功能特性的有效手段。

毛细管电泳及其在蛋白质折叠研究中的应用

简要介绍了毛细管电泳的常用分离模式及其原理，并对毛细管电泳在蛋白质化学领域中的新应用——研究蛋白质折叠和发展前景作了评述。

人重组白细胞介素-1受体拮抗剂高效纯化及不同氧化态转换

为满足科研和治疗的需要,将含有人白细胞介素-1受体拮抗剂(HuIL-1 ra)基因的表达质粒转到大肠杆菌BL21(DE3)内,经IPTG诱导,外源蛋白得到高量表达,并且形成了无活性的包涵体.包涵体在二硫苏糖醇(DTT)和变性剂中溶解,经一步离子交换层析,得到高纯度还原态蛋白.在空气、谷胱甘肽或Cu2+作用下,还原态蛋白会逐渐转向氧化态.氧化态和还原态蛋白在HPLC图谱上得以分离,但非还原性SDS-PAGE分析发现,二者分子量没有差别,表明氧化过程中主要形成分子内二硫键.氧化态人重组白细胞介素-1受体拮抗剂性质稳定,仍然具有较高的生物活性.

二维多光栅折叠光谱分析仪的研制

宽光谱、高分辨、高速光谱获取和分析技术在光电子材料、太阳能、化学、生物医学、环境、国防等领域具有重要的研究意义和应用价值,是现代光谱分析仪器的核心。为了实现宽光谱、高分辨率和快速的光谱测量和分析,在本研究中,突破传统单光栅和棱镜等色散元件有限色散角和光谱效率的限制,采用二维CCD面阵光电探测技术,将具有不同闪耀角和色散特性的10光栅进行集成组合,在200～1000nm光谱区,获得10重折叠光谱,成像在CCD面阵探测器的焦平面上,从而将光谱的有效探测区长度扩展了10倍,达到268mm。经系统定标后,测量结果显示,无需任何机械位移部件,新的光谱分析系统可达到优于0.1nm的分辨率,能够在0.1s时间内完成200～1000nm全光谱数据的快速获取和分析,将能够在科学研究和高科技领域获得重要应用,体现了高性能光谱分析技术研究和发展的趋势。

通过缠结法构建软骨样蛋白质水凝胶

肌肉、软骨等承重组织具有高弹性、高韧性、恢复快的特点,但具有不同的硬度(软骨明显比肌肉硬)。肌肉通过精细控制肌肉蛋白Titin的强制结构域的展开-重折叠来实现其韧性,而关节软骨通过由胶原蛋白和蛋白聚糖组成的缠结网络来实现其高硬度和韧性。蛋白质力学和工程学的进步使得设计出模拟Titin的弹性蛋白和软蛋白生物材料成为可能,以模拟肌肉的被动弹性。然而,更具挑战性的是设计高硬度和高韧性的蛋白质生物材料来模拟软骨等坚韧组织,或开发用于软骨干细胞和祖细胞分化的硬质合成基质。

包涵体蛋白体外复性的研究进展

外源基因在大肠杆菌中高水平表达时 ,通常会形成无活性的蛋白聚集体即包涵体。包涵体富含表达的重组蛋白 ,经分离、变性溶解后须再经过一个合适的复性过程实现变性蛋白的重折叠 ,才能够得到生物活性蛋白。近年来 ,发展了许多特异的策略和方法来从包涵体中复性重组蛋白。最近的进展包括固定化复性以及用一些低分子量的添加剂等来减少复性过程中蛋白质的聚集 ,提高活性蛋白的产率。

可溶性人sPD-L1及其抗体的制备和鉴定

通过固定化金属离子亲和层析进行柱上复性与纯化,获得高纯度的可溶性PD-L1胞外域(sPD-L1),其纯度达95%,纯化的sPD-L1经免疫印迹分析得到验证,并具有与其受体PD-1的特异性结合活性;以该抗原免疫小鼠获得高滴度的抗血清,并以制备的sPD-L1-HiTrap亲和层析柱纯化获得高纯度特异性抗体;将该抗体与另一商业化抗体结合建立了一种灵敏的双夹心ELISA法,检测范围为1ng/mL^100ng/mL,可用于分析可溶性PD-L1的含量。可溶性sPD-L1及其抗体的制备不仅可用于人体内特异性抗体和可溶性PD-L1的检测,同时也为进一步研究其体内外活性及其受体的性质提供了条件。

包涵体复性研究进展(英文)

用基因工程技术在大肠杆菌高水平表达重组蛋白时 ,通常形成无生物活性的包涵体。包涵体在体外经分离、溶解与重折叠后可实现复性 ,表现为具有生物活性的蛋白。总结了包涵体的相关复性技术 。

人EGF受体L2结构域在大肠杆菌中表达、包涵体柱上复性及纯化

以PCR方法从克隆的EGFR胞外区cDNA中扩增编码EGFR_L2结构域的DNA片段,在其3′端加入编码His6标签的序列,与pET_3c连接构建EGFR_L2原核表达载体。该蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中获得高效表达,免疫印迹分析表明表达产物全部以包涵体形式存在,分步透析法和稀释法都不能获得可溶性复性产物,而Ni2+_NTA柱上复性法不仅能够获得可溶性的EGFR_L2蛋白,而且产物同时得到高度纯化,纯度>95%,复性的EGFR_L2与其配基EGF具有特异性的结合活性,但亲和力较低。这表明His6标签不但便于纯化目标蛋白,而且可利用Ni2+_NTA柱进行柱上复性,适用于不易通过常规方法复性的重组蛋白的制备。