重构型人caspase-8基因的表达诱导HeLa细胞凋亡

以两种大、小亚基基因次序颠倒的重构型人caspase 8基因的pIRES2 EGFP真核表达载体转染HeLa细胞 ,用间接免疫荧光染色、免疫细胞化学染色和电镜观察等方法 ,研究重构型人caspase 8基因在HeLa细胞中的表达及其促凋亡活性 .结果显示 ,两种重构型人caspase

重构型人caspase-8基因的表达及其对HeLa细胞生长的影响

目的 克隆人ｃａｓｐａｓｅ－８催化结构域基因片段，并将其改建成２种大、小亚基基因次序颠倒的重构型人ｃａｓｐａｓｅ－８基因，转染ＨｅＬａ细胞，观察重构型人ｃａｓｐａｓｅ－８基因的表达及其对ＨｅＬａ细胞生长的影响。 方法 用ＲＴ－ＰＣＲ法，克隆人ｃａｓｐａｓｅ－８催化结构域基因片段，经重组ＰＣＲ改造，构建大、小亚基基因次序颠倒的重构型人ｃａｓｐａｓｅ－８基因。将其克隆入绿色荧光蛋白（ＧＦＰ）真核表达载体ｐＩＲＥＳ２－ＥＧＦＰ，转染ＨｅＬａ细胞，用荧光显微镜和倒置显微镜镜观察细胞的形态和结构。 结果用ＲＴ－ＰＣＲ法，成功地克隆了人ｃａｓｐａｓｅ－８催化结构域基因片段，构建了３种重构型人 ｃａｓｐａｓｅ－８基因及其真核表达载体。转染ＨｅＬａ细胞后，重构型人ｃａｓｐａｓｅ－８基因的表达可导致ＨｅＬａ细胞死亡。 结论重构型人ｃａｓｐａｓｅ－８基因在ＨｅＬａ细胞中的表达可以有效地引起ＨｅＬａ细胞死亡。

三种重构型人caspase-8促宫颈癌HeLa细胞凋亡的效率

背景与目的细胞凋亡是一种进化上高度保守的细胞死亡方式,将高活性的促凋亡分子靶向性地导入肿瘤细胞而诱导肿瘤细胞凋亡是肿瘤基因治疗的潜在策略。在证实了大、小亚基次序颠倒的重构型人caspase-8具有持续的诱导宫颈癌细胞HeLa凋亡活性的基础上,本研究旨在分析3种重构型人caspase-8(Casp8CD、Rev8和Rev8L)促HeLa细胞凋亡的效率,探讨重构型人caspase-8作为诱导肿瘤细胞凋亡候选分子的可行性。方法脂质体法将Casp8CD、Rev8和Rev8L基因的pIRES2鄄EGFP真核表达载体转染入人HeLa和MCF鄄7细胞,用荧光显微镜观察目的基因的表达及其促凋亡效应,MTT法和细胞计数法检测3种重构型人caspase鄄8基因表达产物的促凋亡效率。用生物信息学方法分析Rev8和Rev8L分子大、小亚基间连接肽段的柔性。结果荧光显微镜观察结果表明,3种重构型人caspase-8基因在HeLa和MCF-7细胞中得到表达,其中Rev8和Rev8L基因的表达能有效促进被转染细胞的凋亡,细胞表现为凋亡性容积减少(AVD)。MTT结果显示,Rev8和Rev8L基因转染组在转染后20h,A570值即开始明显降低(与对照组相比)。细胞计数结果表明,转染后24h,Casp8CD、Rev8和Rev8L基因转染组的细胞死亡率分别为16.9%、52.3%和47.7%,而转染后48h各组相应的细胞死亡率分别为12.9%、51.6%和61.2%?

浙江地区汉族人群caspase-8、-10基因四个单核苷酸多态性位点的单倍型研究

目的分析汉族人群caspase-8、-10基因的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisins，SNPs）位点及其构成的单倍型，为研究caspase-8、-10基因与多基因复杂疾病的关联分析奠定基础。方法采用PCR、变性高效液相色谱技术和DNA测序技术检测caspase-10基因的第2．5外显子，caspase-8基因的第8-10外显子及其部分侧翼序列的多态性位点；分析配对位点的连锁不平衡关系，最大期望值法估算它们构成的单倍型。结果（1）caspase-10基因的第2、5外显子分别检出一个SNP位点A2823G和A12799G，其中A12799G是新发现的低信息度的SNP；caspase-8基因中检测到3个SNP位点A43466G、G51484A、G52951A，分别位于第8、9外显子和第9内含子；它们均未改变所编码蛋白的一级结构；（2）caspase-10基因中A2823G位点与caspase-8基因中3个位点间已达到连锁平衡，caspase-8基因中A43466G与G52951A、G51484A与G52951A也达到连锁平衡，连锁不平衡系数分别接近于0；只有A43466G与G51484A存在强的连锁不平衡，连锁不平衡系数接近于1；（3）caspase-10基因的A2823G位点与caspase-8基因的3个位点预计产生11种单倍型，其中A-2823／A-43466／G-51484／G-52951是主要单倍型，频率为0．381l，其次是A．2823／A-43466／G-51484／A-52951，频率为0．2536；这4个SNP位点联用，多态信息含量可达到0．7106。结论浙江地区汉族人群caspase-10、-8基因中的SNP位点至少处于3个不同的单倍型块；联合多个相邻的位点构成单倍型，可以弥补单个SNP信息度较低的不足。

重构型人caspase-7基因对肿瘤细胞的促凋亡作用

目的观察重构型caspase-7的表达对肿瘤细胞的凋亡诱导作用。方法用反转录PCR方法获取野生型人caspase-7基因,用重组PCR构建了两种重构型caspase-7基因,即大、小亚基序列次序颠倒的rev-ca2spase-7以及N-端带有绿脓杆菌外毒素转膜结构域部分肽段的融合蛋白(PEⅡ=rev-caspase-7)的基因。将两种重构型caspase-7基因克隆入表达载体pIRES2-EGFP,脂质体法转染肿瘤细胞,通过荧光显微镜观察、电镜观察、MTT检测等方法检测重组基因的表达及其对肿瘤细胞的促凋亡活性。结果 成功获得了caspase-7基因,构建了rev-caspase-7基因和rev-caspase-7与绿脓杆菌外毒素(PE)转膜肽段的融合蛋白(PEⅡ-rev-caspase-7)基因及其表达载体。将两种重构型caspase-7转染肿瘤细胞后,证实细胞发生凋亡。结论两种重构型caspase-7均可以有效地诱导肿瘤细胞发生凋亡。

右旋甲硫氨酸联合化疗诱导胃癌细胞凋亡的机制

目的探索右旋甲硫氨酸(D-Met)和联合应用周期特异性化疗药物诱导胃癌细胞凋亡的机制和途径。方法将人胃癌细胞株SGC7901分别置于六种不同培养基中:含LMet、含D-Met、不含Met而替以同型半胱氨酸(Met-Hcy+),或在上述培养基中分别加入5FU。培养48h后,在蛋白和mRNA水平检测凋亡相关基因bcl2、bax和p53的表达,以及caspase3、caspase-8和caspase-9的活性。结果各组间bcl-2、bax和p53蛋白表达无明显差异;各组均见baxmRNA和p53mRNA表达,但未见bcl-2mRNA表达。三种培养基组间caspase-3活性无统计学差异,而DMet组的caspase8活性明显低于LMet和Met-Hcy+组,LMet组的caspase9活性显著高于Met-Hcy+和DMet组;与未加入化疗药物时相比,联合应用5FU后,各组caspase3、caspase8和caspase9活性均明显提高。结论D-Met诱导胃癌细胞凋亡至少部分系通过p53非依赖途径所介导,且可能以caspase非依赖方式进行;无证据支持bcl2和bax参与凋亡的调节;5FU可能既通过死亡受体信号传递途径,又通过线粒体途径诱导肿瘤细胞凋亡。