重楼皂苷D激活Hippo通路抑制多形性胶质母细胞瘤细胞增殖与侵袭

目的探讨重楼皂苷D(polyphyllin D,PPD)抑制多形性胶质母细胞瘤(glioblastoma multiforme,GBM)恶性生物学行为的分子机制。方法使用的细胞模型为DBTRG-05MG(DBTRG)和A172细胞株。将PPD处理后的细胞,通过MTT实验、实时无标记细胞分析技术(real-time cellular analysis,RTCA)和集落形成实验检测PPD对细胞存活能力的影响;流式细胞术、DAPI染色、Westernblot检测PPD对细胞凋亡的影响;Transwell细胞侵袭实验和RTCA测定PPD对细胞侵袭能力的影响;划痕愈合实验和高内涵成像分析系统测定PPD对细胞迁移能力的影响;Westernblot测定PPD所导致的Hippo信号通路相关蛋白质的表达以及蛋白质的磷酸化水平的变化;通过Caspase-3抑制剂(Z-DEVDFMK,Z-DEVD)与PPD共处理明确Caspase-3对MST1的激活作用;利用分子对接研究PPD与Caspase-3在三维空间的相互作用;通过靶点稳定性药物亲和反应实验明确PPD与Caspase-3的直接结合。结果PPD对GBM细胞的增殖具有显著的抑制能力。PPD能够诱导GBM细胞发生凋亡。PPD处理组的GBM细胞侵袭、迁移能力显著下降。PPD能够下调YAP蛋白及其下游靶基因Cyr61、c-Myc的转录,促进YAP上游信号分子LATS1、MST1的磷酸化,表明PPD能够激活GBM细胞中的Hippo信号通路。Z-DEVD能够拮抗PPD对MST1的磷酸化,表明PPD通过激活Caspase-3进而激活Hippo信号通路。分子对接模拟发现PPD能够在C-末端区域与Caspase-3结合;基于靶点稳定性的药物亲和反应实验表明PPD阻碍了蛋白酶pronase对Caspase-3的水解作用,表明PPD与Caspase-3具有直接结合作用。结论PPD通过靶向Caspase-3激活Hippo信号通路抑制GBM细胞增殖、侵袭和迁移并诱导凋亡。

重楼皂苷D抑制A549细胞转移作用及机制研究

目的观察重楼皂苷D对结肠癌细胞A549迁移与侵袭,以及基质金属蛋白酶2及9(MMP-2,MMP-9)表达的影响。方法培养结肠癌细胞A549,加入不同质量浓度的重楼皂苷D(1,2μmol/L),采用划痕试验,Transwell侵袭试验观察重楼皂苷D对A549迁移与侵袭的影响,以免疫印迹试验(Western Blot)法检测细胞中MMP-2和MMP-9蛋白的表达。结果与结论重楼皂苷D可有效抑制结肠癌细胞A549的迁移、增殖与侵袭,可浓度依赖性地降低MMP-2和MMP-9的表达。机制可能为其降低了MMP-2和MMP-9的表达。

重楼皂苷D对人胰腺癌细胞增殖和凋亡的影响

重楼皂苷D(polyphyllin D)是重楼中的一种甾体皂苷单体,具有抗菌、镇痛、镇静、抗肿瘤等多种药理作用,但在胰腺癌中少有报道。该研究通过检测凋亡相关指标,探讨polyphyllin D对人胰腺癌Panc-1细胞增殖和凋亡的影响及相关作用机制。采用CCK-8法检测不同浓度的(0,1,2,3,4,5μg·μL-1)polyphyllin D分别处理胰腺癌Panc-1细胞24,48,72 h后,观察对细胞增殖的影响。采用流式细胞术对细胞周期、细胞线粒体膜电位(mitochondrial membrane protential,MMP)进行检测,Annexin-V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡情况,Western blot法检测细胞色素C (cytochrome C,Cyto C),Bax,Bcl-2,cleaved caspase-3,cleaved caspase-9的蛋白表达情况。结果表明,与对照组相比,polyphyllin D能够时间和浓度依赖性地抑制Panc-1细胞的增殖活性。流式细胞术检测显示polyphyllin D能浓度依赖性使细胞阻滞于S期和G2/M期,MMP明显降低,细胞凋亡率随polyphyllin D作用浓度增加而增加。Western blot结果显示,polyphyllin D能浓度依赖性地上调Bax,Cyto C,cleaved caspase-3和cleaved caspase-9的蛋白表达水平,下调Bcl-2的蛋白表达水平。以上研究结果提示,polyphyllin D能抑制胰腺癌Panc-1细胞的增殖,其机制可能与阻滞细胞的生长周期以及通过线粒体途径诱导细胞的凋亡相关。

重楼皂苷D通过诱导凋亡及分化抑制K562细胞的增殖

目的探讨重楼皂苷D对慢性粒细胞白血病细胞株K562的增殖抑制作用及其机制。方法四甲基偶氮唑蓝（MTT）法测定重楼皂苷D对K562细胞增殖抑制作用；流式细胞仪检测重楼皂苷D对K562细胞凋亡的影响；Western blotting检测相关蛋白的表达。结果重楼皂苷D对K562细胞有明显的增殖抑制作用，其作用24 h的半抑制浓度（IC50）值为（0.8±0.1）μmol/L；流式细胞仪检测结果显示，浓度为0、0.4、0.8、1.2 μmol/L重楼皂苷D作用K562细胞24 h后细胞凋亡率分别为（1.73±0.33）%、（14.47±2.57）%、（24.10±3.52）%、（31.51±4.09）%，呈依次增加趋势，差异有统计学意义（F=58.231，P＜0.001）。Western blotting结果显示，重楼皂苷D能够下调Bcl2的表达，上调Bax水平，使Bcl2/Bax比值明显降低，上调细胞色素c、活化caspase3表达。此外，重楼皂苷D能够明显上调细胞表面分化抗原CD14的表达，诱导细胞向单核巨噬细胞分化。结论重楼皂苷D能够明显抑制K562细胞增殖，其作用机制可能是通过诱导细胞凋亡及促进细胞分化实现的。

重楼皂苷D对人慢性粒细胞白血病K562细胞增殖的抑制作用及其机制

目的 探讨重楼皂苷D对人慢性粒细胞白血病细胞株K562增殖的抑制作用及其机制.方法 选用浓度为0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.2、2.4μmol/L重楼皂苷D作用于K562细胞24 h,用CCK-8法检测重楼皂苷D对K562细胞增殖的抑制作用;流式细胞术检测重楼皂苷D对K562细胞凋亡以及细胞周期分布的影响;Western blot方法检测相关蛋白的表达.结果 重楼皂苷D可显著抑制K562细胞增殖,24 h的半数有效抑制浓度（IC50）为（0.9±0.1）μmol/L.流式细胞术检测结果显示,浓度为0.9μmol/L重楼皂苷D作用于K562细胞12、24 h后,细胞早期凋亡率较对照组的（2.05±0.45）%分别提高到（11.46±1.51）%、（28.87±2.35）%,差异有统计学意义（F=38.637,P＜0.05）.重楼皂苷D能够显著下调bcl-2、CDK1、cyclin B1、bcr-abl融合蛋白的表达,上调Bax、细胞色素C、活化的caspase-3以及p21的表达（均P＜0.05）.此外,重楼皂苷D能够将细胞周期阻滞在G2/M期（F=42.355,P＜0.05）.结论 重楼皂苷D能够明显抑制慢性粒细胞白血病K562细胞增殖,其作用机制可能是诱导细胞凋亡及促进细胞周期阻滞.