乙型肝炎病毒核心颗粒重组疟疾表位疫苗的免疫原性研究

全世界有2～4亿的疟疾感染者,且每年有100万～200万人死于恶性疟疾。既往研制的疟疾疫苗有用放射线照射的疟原虫孢子体、合成肽疫苗和重组乙型肝炎病毒(HBV)颗粒疟疾疫苗。以放射线照射的孢子体免疫可诱导保护性体液和细胞免疫,缺点是孢子体不能在体外进行培养。合成肽疫苗包含环孢蛋白(CS)

基于乙型肝炎病毒核心蛋白的颗粒性肽展示载体的构建

为提高HBVpreS1aa21 47的免疫原性,将1～6拷贝的preS1(21 47)片段以串联方式插入HBcAg的aa78和aa82之间,在大肠杆菌中进行表达和纯化.携带1～3拷贝的重组抗原CI、CII和CIII的表达产量约占菌体总蛋白的20%,而携带4～6拷贝的重组抗原则未见明显表达.电镜检测显示重组抗原CI、CII和CIII可以形成形态与HBcAg类似的类病毒颗粒,颗粒直径在30～34nm之间.ELISA分析显示这3种VLP抗原具有很强的preS1抗原的免疫反应性,而对HBc单克隆抗体则基本失去反应性.提示外源多肽pre(21 47)可被有效地递呈至类HBc颗粒的表面,且外源多肽的插入使HBc主要的免疫优势表位遭到了破坏.这些证据表明利用HBcAg的专一性呈递能力来构建多价抗原可作为免疫原设计时的一种策略.

乙型肝炎病毒核心抗原HBcAg基因重组杆状病毒的构建及鉴定

目的利用杆状病毒表达系统(BEVS)构建含乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)基因的重组杆状病毒。方法采用PCR法从含乙型肝炎病毒全基因序列(adw)的质粒pHBV1中扩增出HBVC基因,亚克隆到pGEM-T载体,然后将HBVC基因插入载体pAcGHLT-A中,构建含有HBVC基因的重组质粒pAcGHLT-HBcAg,与苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)联合转染秋粘虫细胞(Sf9),获得含有HBVC基因的重组杆状病毒。采用限制性内切酶酶切和DNA序列分析对重组病毒进行鉴定。结果利用杆状病毒表达系统,成功地构建了含HBVC基因的重组杆状病毒,感染昆虫细胞Sf9后,PCR检测可以扩增出相应大小的片段。结论利用BEVS成功构建了含有HBVC基因的重组杆状病毒,为进一步的研究奠定了基础。

乙型肝炎病毒核心颗粒的结构和包装

本文从结构和功能的关系出发阐述乙型肝炎病毒核心颗粒的结构组成及其在装配中的作用

晚期血吸虫病患者检测血清乙型肝炎病毒核心抗体的临床意义

近年来，很多学者强调检测乙型肝炎病毒核心抗体（抗-HBc）对肝炎的诊断与鉴别诊断具有实用价值。本文报道用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测晚期血吸虫病（晚血）患者血清抗-HBc。

重组痘苗病毒表达乙肝核心抗原基因的研究

pMM2066质粒以EcoR Ⅰ酶切回收ATG前只有12bp的乙肝核心抗原基因片段,将此基因片段插入痘苗转移载体pGJP-5的P7.5启动子后,组建成P5.C2066质粒,通过细胞内同源重组技术,于BUdR存在条件下用人TK-143细胞筛选出三株能表达HBcAg的重组痘苗病毒株。感染细胞上清液1:64稀释时仍能用ELISA法测到HBcAg活性,同时也能测到滴度相近的HBeAg活性。免疫电镜可见平均为26.6nm的HBcAg颗粒。进行了不同量的重组痘苗病毒感染不同细胞,和不同培养温度对HBcAg表达影响的观察。

预防乙型肝炎的酵母重组疫苗

预防乙型病毒性肝炎,早年都使用血源性乙肝死疫苗。换句话说,就是将含有乙型肝炎病毒的人血浆中的乙肝病毒浓缩后杀死,再将其注入人体,使接种疫苗者产生抗乙肝病毒的抗体,以达到抗御乙肝病毒攻击以致感染的目的。虽说可获满意结果,但仍存在传播其他血源性疾病的危险性。到1986年酵母重组乙型肝炎疫苗获准正式使用,使上述危险因素得以消除,

蓝舌病16型病毒核心样颗粒的获取与鉴定

为了制备一种新型基因工程疫苗BTV-16 VLP疫苗,将蓝舌病病毒16型VP3与VP7基因片段插入杆状病毒双表达载体pFastBac Dual质粒中,通过转染Sf9细胞,同时表达VP3与VP7蛋白。经负染后电镜观察到有与蓝舌病病毒形态相似的核心样颗粒,表明蓝舌病VP3与VP7蛋白能自主组装形成核心样颗粒,并通过Western Blot试验验证该核心样颗粒与蓝舌病病毒具有相同的抗原性。因此本研究成功构建出16型蓝舌病病毒核心样颗粒,为病毒样颗粒装配打下了基础,为制备16血清型BTV VLP疫苗做好前期准备。

HBcAg病毒样颗粒与疫苗设计

寻找有效的疫苗来治疗肿瘤和微生物感染性疾病一直是人们追求的目标。近年来,基于乙型肝炎病毒核心抗原的颗粒疫苗在该领域取得了一些新的进展。本文就这些新的进展作一综述。

乙型肝炎病毒感染的血清学标记

病毒性肝炎是当前国内流行较严重的传染病。虽然有许多种病毒如巨细胞病毒、EB病毒、单纯疱疹病毒、黄热病病毒、风疹病毒、腮腺炎病毒等,都可引起人类的病毒性肝炎。但是,习惯上只将侵犯的靶器官是肝脏的甲型、乙型和非甲非乙型肝炎病毒所引起的肝炎统称为病毒性肝炎。如能及时作出病原学诊断,对于预防、治疗与予后将有直接关系。鉴于乙型肝炎病毒的异质性,为了提高对其各种抗原性在流行病学及临床学的实际意义的了解,现从以下几方面做一综合叙述。

HBV病毒样核心颗粒应用研究进展

病毒样颗粒(virus like particles,VLPs)是一种模拟病毒的颗粒形态特点,将外源基因片断产物呈递到病毒颗粒表面而形成的嵌合颗粒。它有与病毒颗粒相同的外部形态,甚至还有某些病毒受体的天然配体,同时还可将其他病原的特异性抗原等呈递在自己的表面,因而在病原体的疫苗研究和基因治疗研究中发挥着重要的作用。目前研究得较多的病毒样颗粒有HIV gag颗粒、HBc颗粒、HBs颗粒、酵母Ty颗粒等等,其中HBc VLP较受人注目。 HBc有自动组装的特性,其形成的核心颗粒有显著刺激B细胞、T辅助细胞及细胞毒T细胞产生免疫反应的能力,而且HBc颗粒在人体内没有细胞毒性作用,再加上HBc容许插入外源片段并可保持或增强外源蛋白的免疫活性,基因表达的杂合蛋白在多种表达体系中都具备颗粒形成能力,且形成的颗粒易于纯化制备。以HBc为载体的疫苗生产研究、基因治疗方法研究在国外日益受到重视。现将有关这方面的研究进展简述如下。

乙型肝炎疫苗漫谈

乙型肝炎疫苗的本质是什么？完整的乙型肝炎病毒（HBV）颗粒直径为42nm，分为包膜与核心两部分。包膜上的蛋白质，即乙型肝炎表面抗原（HBsAg），在肝细胞内合成，大量释出于血液循环中。核心部分含有环状双股DNA、DNA聚合酶（DNAP）、核心抗原（HBCAg）和e抗原（HBeAg）是病毒复制的主体。

乙型肝炎病毒核心蛋白病毒样颗粒作为疫苗载体的研究进展

乙型肝炎病毒核心蛋白(hepatitis B virus core protein,HBc)可自发形成二十面体的病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)结构,VLPs结构有利于诱发特异性的体液和细胞免疫反应。将外源性抗原表位插入至HBc的N-末端、C-末端或其内部免疫显性区,可诱导机体产生针对外源性抗原的特异性免疫应答。本文对HBc作为疫苗载体的结构基础、设计方法、佐剂效应及其应用等内容作一综述。

HBV核心启动子部分缺失重组质粒的构建

目的 构建乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）核心启动子（ＣＰ）部分缺失的真核表达质粒。方法 利用线性化的、从ＣＰ上游顺 序开始且含完整转录单元的ＨＢＶ 基因克隆（Ｐ３．８Ｉ质粒）为工具，采用分子克隆、人工定点突变、ＰＣＲ－ＲＦＬＰ，鉴定和测 序分析等技术构建目的载体。结果 成功构建了ＨＢＶ全基因ＣＰ ２０／２１个ｂｐ缺失（ｎｔ １７４８／１７４７－１７６７）和ＣＰ２０／２１个ｂｐ 缺失＋１８９６热点变异的重组真核质粒表达质粒，并经ＰＣＲ－ＲＦＬＰ序列分析证实。结论 此重组真核表达质粒构建可为 体外进一步研究上述变异的生物学意义奠定基础。

稳定表达含HBV多表位短肽的杂合HBc颗粒的重组NS-1细胞株的筛选与鉴定

目的建立稳定表达含HBV多表位短肽的杂合HBc颗粒的重组NS-1细胞株。方法将以HBV多表位复合基因取代脊区基因的杂合HBc真核表达质粒转染NS-1细胞,经G418及亚克隆筛选高表达阳性细胞株,并以RT-PCR、ELISA、间接免疫荧光及Western blotting等方法检测、鉴定重组细胞表达产物。结果筛选所得稳定表达细胞株经RT-PCR、ELISA、间接免疫荧光及Western blotting等方法检测均呈阳性反应,而阴性对照及空白对照未出现相应阳性反应。结论筛选获得稳定表达含HBV多表位短肽的杂合HBc颗粒的重组细胞株,命名为NS/HBc-Mep。为建立HBc-Mep特异的cELISA及CTL活性测定等实验方法提供可靠的靶细胞。

乙型肝炎病毒核心抗原病毒样颗粒在疫苗研究中的应用

乙型肝炎病毒核心抗原（hepatitis B core antigen,HBcAg）病毒样颗粒（virus like particles,VLP）具有独特的颗粒型结构和免疫学特性.近30年来,人们利用其自身免疫原性、载体蛋白特性和免疫佐剂特性,对HBcAg-VLP在疫苗领域的应用进行了深入的研究.本文就上述研究进展进行综述.

血清乙肝病毒颗粒的存在形式及其临床价值

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)在宿主体内的复制以病毒颗粒的形式存在,血清中的病毒复制产物是实验室诊断和监测慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B, CHB)的基础。寻找血液中能够有效反映肝内病毒转录活性和药物疗效的生物学标志物一直是热点和难点。该文对HBV颗粒性产物在CHB患者血清中的存在形式及其对CHB抗病毒药物的疗效监测和停药时机判断的意义,特别是新标志物如HBV RNA、HBV核心相关抗原(HBcrAg)和空病毒颗粒等的发现及应用作一述评。

以乙型肝炎病毒核心蛋白为载体的PRRSV病毒样颗粒疫苗的构建

为采用乙型肝炎病毒核心蛋白(HBc)为载体,构建含美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5糖基化蛋白抗原表位的HBc-GP5病毒样颗粒(VLPs)疫苗,对HBc序列进行密码子优化,将其克隆至pET-28a(+)载体中,获得质粒pEO-NEW。在HBc刺突顶端的免疫显性区插入优化后的GP5序列,获得重组表达质粒pEO-LEORF5,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG 22℃诱导表达。利用SDS-PAGE和Western-blot验证融合蛋白pEO-LEORF5的表达。超声破碎后利用蔗糖密度梯度离心对融合蛋白进行纯化,最后用透射电镜观察VLPs的形成情况。结果表明,重组表达质粒pEO-LEORF5构建正确。表达的融合蛋白的分子质量为32ku,以包涵体和可溶性两种形式表达。经浓缩纯化后融合蛋白纯度可达67%,且能自主装配为VLPs。本试验成功构建出新型HBc-GP5VLPs候选疫苗,为研发新型PRRS疫苗提供了新思路。

以乙型肝炎病毒核心蛋白颗粒为载体的流感通用疫苗的构建

目的构建以乙型肝炎病毒核心蛋白(Hepatitis B virus coreprotein,HBc)颗粒为载体的含流感病毒M2基质蛋白胞外功能区(M2 ectodomain,M2e)和核蛋白(Nucleoprotein,NP)保守表位的流感通用疫苗,评价其抗不同亚型流感病毒感染的保护作用。方法采用基因工程方法将流感病毒M2e的3拷贝重复片段与NP的CTL表位串联,插入HBc刺突顶端的免疫优势决定区,构建重组表达质粒pET-21a-HBc-3M2e-NP,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG16℃低温诱导表达。表达的融合蛋白HBc-3M2e-NP经纯化后,电镜观察病毒样颗粒形成情况。纯化的融合蛋白分别经鼻腔和腹腔免疫小鼠,对照组注射等体积的PBS,间接ELISA法检测小鼠血清IgG抗体水平;流式细胞术检测小鼠脾组织中CD4+、CD8+T淋巴细胞水平;以流感病毒攻毒,检测融合蛋白的保护效果。结果重组表达质粒pET-21a-HBc-3M2e-NP经PCR及双酶切鉴定证明构建正确。表达的融合蛋白相对分子质量约为29000,以包涵体和可溶性两种形式表达,且可与鼠抗M2e单抗发生特异性反应。纯化的融合蛋白纯度大于90%,且能够自动装配成病毒样颗粒。用该病毒样颗粒免疫小鼠,可诱导小鼠产生针对不同流感病毒毒株的特异性抗体;2种途径免疫的小鼠脾组织中CD4+T淋巴细胞含量和CD4+/CD8+T淋巴细胞比例均较对照组明显升高;攻毒试验结果显示,具有交叉保护作用。结论构建的流感通用疫苗能够诱导机体产生高水平的体液免疫和细胞免疫应答及有效的交叉保护作用,为流感通用疫苗的深入研究奠定了基础。

重组乙型肝炎病毒核心抗原的免疫原性及其对乙型肝炎病毒表面抗原的免疫增强作用

目的探讨重组乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)的免疫原性及其对重组乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)的免疫增强作用。方法用透射电镜观察HBcAg、HBsAg及HBcAg+HBsAg混合抗原病毒样颗粒(Virus-like particle,VLP)的形态。将小鼠随机分为6组:阴性对照组(NS)、HBcAg组(C)、HBsAg组(S)、HBsAg+铝佐剂组(S+Al)、HBsAg+HBcAg混合组(S+C)及HBsAg+HBcAg+铝佐剂组(S+C+Al),用相应抗原免疫各组小鼠,分别于第0天、第14天经小鼠双侧大腿肌肉进行初次和加强免疫1次,间接ELISA法检测各组小鼠血清中HBsAg和HBcAg的特异性抗体水平,分析HBsAg特异性抗体亚类,ELISPOT法检测各组小鼠脾细胞中HBsAg特异性IFNγ、HBcAg特异性IFNγ及HBsAg特异性IL-4水平。结果电镜观察可见HBsAg和HBcAg均呈大小均一的VLP结构,二者混合后有聚集现象。初次免疫后,S+C组的HBsAg特异性抗体水平与S组差异无统计学意义(P=0.074),加强免疫后,S+C组HBsAg特异性抗体水平明显高于S组(P=0.002),C组和S+C组均可产生高水平HBcAg特异性抗体。S组HBsAg抗体亚类以IgG1为主,S+C组以IgG2a为主。S+C组HBsAg特异性IFNγ斑点数明显高于S组、S+Al组和S+C+Al组(P<0.05),C组与S+C组HBcAg特异性IFNγ斑点数均较高,与S+C+Al组比较,S+Al组HBsAg特异性IL-4斑点数明显升高(P=0.026)。结论 HBcAg具有良好的免疫原性,可增强HBsAg的免疫反应,使反应向Th1方向极化,为治疗性乙肝疫苗的研发奠定了基础。