表达猪传染性胃肠炎病毒S蛋白的重组乳酸菌口服免疫小鼠特异性免疫应答分析

将表达猪传染性胃肠炎病毒S蛋白的重组乳酸乳球菌pNZ8112-Sa/NZ9000经口服免疫BALB/c小鼠,在免疫后的不同时间收集免疫鼠粪便样品,断尾采血收集血液样品并分离血清,用间接ELISA技术检测血清中的IgG抗体及血清和粪便中的IgA抗体的动态产生规律;在加强免疫后流式细胞仪检测分析外周血T细胞的变化情况及无菌收集免疫鼠的肠黏液,经中和试验检测其抗体的中和能力。结果表明重组菌株口服免疫小鼠后血清中的IgG和IgA抗体产生能力由于非特异性干扰不能确定,外周血中T细胞百分数在实验组和对照组间变化不显著;粪便中的IgA抗体水平产生效果明显;黏液的抗体具有一定的中和能力,其效价检测结果为1:36。

猪传染性胃肠炎病毒S基因重组乳酸菌免疫小鼠的研究

将含有猪传染性胃肠炎病毒S基因的重组乳酸菌PNZ8149/NZ3900口服(灌胃)免疫BALB/C小鼠,第3次加强免疫后10 d捕杀小鼠,采集血液、脾脏、粪便,处理后采用T淋巴细胞增殖试验及间接ELISA方法,检查免疫小鼠对外源基因表达产物的应答情况。结果表明,含有S基因的重组乳酸菌经口服免疫小鼠后,血清中的IgG、粪便中的sIgA与对照组有明显的差异(P<0.05)。结果说明,含有猪传染性胃肠炎病毒S基因的重组乳酸菌,可以诱导小鼠产生良好的针对猪传染性胃肠炎病毒的全身体液和黏膜免疫应答。

表达猪传染性胃肠炎S-AD片段的重组乳酸菌对小鼠的免疫原性影响

将已证实能稳定复制猪传染性胃肠炎S基因AD片段的重组乳酸菌口服免疫BALB/c小鼠,每组于免疫前和免疫后的第7天、第14天、第21天分别取3只小鼠眼球采血、取肠道内容物、分离脾细胞,于免疫的第28天将剩下的小鼠全部取眼球采血、取肠道内容物、分离脾细胞,用于ELISA抗体、肠黏膜SIgA水平及淋巴细胞增殖的检测。经细胞免疫和体液免疫检测,该乳酸菌口服疫苗具有良好的免疫效果。

表面展示C型产气荚膜梭菌α，β毒素蛋白重组乳酸菌的构建及反应原性分析

构建表达C型产气荚膜梭菌α,β1和β2毒素蛋白的重组乳酸菌,并对表达蛋白反应原性进行鉴定。通过PCR构建pSIP409-pgsA’-α,pSIP409-pgsA’-β1以及pSIP409-pgsA’-β2质粒,并将三种质粒电转入植物乳杆菌NC8后诱导表达,通过Western-blot和间接免疫荧光检测目的蛋白的表达情况。构建的NC8-pSIP409-pgsA’-α,NC8-pSIP409-pgsA’-β1以及NC8-p SIP 409-pgsA’-β2三种重组乳酸菌能成功表达C型产气荚膜梭菌α,β1和β2毒素蛋白,三种表达的融合蛋白大小分别为61 kDa、52 kDa以及46 kDa。三种重组乳酸菌表达了C型产气荚膜梭菌α,β1和β2毒素蛋白且与制备的多抗具有良好的反应原性,为C型产气荚膜梭菌口服疫苗的研制奠定基础。

猪产毒素大肠杆菌K88黏附素FaeG基因重组乳酸菌对小鼠免疫性能的影响

目的为获得临床对猪大肠杆菌病较好的预防方法,研究猪产毒素大肠杆菌K88黏附素FaeG基因的重组乳酸菌对小鼠免疫性能的影响。方法将重组乳酸菌经口服(灌胃)免疫BALB/C小鼠,加强免疫后7 d处理小鼠,采集血液、脾脏、粪便,处理后采用试剂盒及间接ELISA方法,检查小鼠免疫性能变化情况。结果重组乳酸菌经口服免疫小鼠后,提高了小鼠生长初期的脾脏指数及细胞因子(IL-2)的含量,加强免疫后粪便中的sIgA与对照组相比,差异极显著(P<0.01),血清中猪ETEC(K88)的特异性抗体水平高于对照组,差异性达到了统计学上的显著水平(P<0.05)。结论含有猪ETEC K88黏附素FaeG基因的重组乳酸菌,可以诱导小鼠产生良好的针对猪产毒素大肠杆菌的全身体液和黏膜免疫应答。

表达禽β-防御素6重组乳酸菌的构建及其免疫调节活性检测

为构建表达禽β-防御素6(AvBD6)的重组乳酸菌并检测重组蛋白AvBD6(rAvBD6)的免疫调节活性,本研究根据GenBank AvBD6的参考序列,经过密码子优化后合成了AvBD6:AvBD6(G4S)3 AvBD6(G4S)3 AvBD6(G4S)3 AvBD6(4×AvBD6)串联基因序列,构建了表达rAvBD6的食品级乳酸菌表达菌株。经western blot检测显示,目的蛋白呈可溶性表达于乳酸菌细胞质中。以重组乳酸菌裂解上清为重组蛋白,与鸡外周血单个核细胞进行体外相互作用试验,荧光定量PCR结果显示,经rAvBD6刺激鸡外周血单个核细胞能够显著提高IL-10(p<0.0001)、IL-12p70(p<0.05)转录水平;重组蛋白与鸡巨噬细胞体外相互作用试验的荧光定量PCR结果显示,经rAvBD6处理的鸡巨噬细胞也能够提高IL-10、IL-12p70的转录水平(p<0.05);重组蛋白刺激干扰素调节因子IRF信号激活报告细胞系774-DualTM,结果显示rAvBD6显著激活了该巨噬细胞的IRF信号通路(p<0.05);SPF鸡注射重组蛋白两周后,采用ELISA检测鸡血清IFN-γ、IL-2和IL-10表达水平,结果显示其IFN-γ、IL-10和IL-2的含量显著高于空菌对照组(p<0.05)。上述结果表明:rAvBD6在体内外显示了较强的免疫激活和免疫调节特性,具有作为免疫佐剂或免疫增强剂的潜力。本研究为新型食品安全级动物免疫佐剂或免疫增强剂的研发奠定了基础。

重组乳酸菌用于疾病治疗和预防的研究进展

乳酸菌在食品工业中有着悠久的使用历史,并且由于其安全性、内在的有益健康效应和巨大的生物技术潜力,在治疗中也呈现越来越大的吸引力。随着黏膜免疫的发展,对乳酸菌表达系统的研究主要集中在不同位置抗原表达的遗传工具的产生上。目前已知的能够使用乳酸菌作为载体来递送各种的治疗分子,主要是通过分泌或表面展示,它们被用于治疗或预防多种疾病:炎症性肠病、感染、自身免疫性疾病,甚至癌症。本文回顾了有关使用重组乳酸菌作为黏膜递送载体和相关健康益处的相关数据,讨论了它们用于递送治疗性蛋白质的用途,同时也关注了治疗性肽的递送,重点是最常用的乳球菌属和乳酸杆菌属。

基因重组乳酸菌r-L.Lactis-VP2-RCK对IBDV母源抗体不同水平雏鸡的免疫效果

母源抗体是早期干扰活疫苗免疫效果的重要因素,通过研究商品蛋鸡法氏囊母源抗体的消长规律,并且在母源抗体达到最高峰的时候,观察免疫重组乳酸菌r-L.Lactis-VP2-RCK的免疫效果是否受到母源抗体的干扰。结果显示,母源抗体在3日龄~6日龄的时候达到最高峰,随后开始逐渐衰减;在6日龄母源抗体达到最高峰时,对低、中等和高水平的母源抗体雏鸡免疫重组乳酸菌r-L.Lactis-VP2-RCK。3个免疫组都能在免疫后1周迅速产生较高的中和抗体。研究表明,重组乳酸菌r-L.Lactis-VP2-RCK免疫雏鸡不受母源抗体干扰,并能产生显著的免疫应答,该研究结果为进一步研制商品化的重组乳酸菌活载体疫苗奠定了基础。

表达禽流感病毒NP和M2融合基因重组乳酸菌的构建及鉴定

为了在乳酸菌中表达H9N2亚型禽流感病毒(AIV) NP和M2基因并检测其反应原性,先以pMD19-T-M2质粒作为模板,采用PCR方法克隆M2全长基因,然后将M2基因亚克隆入p SIP409-pgsA'-NP质粒中,构建重组质粒pSIP409-pgsA'-NP-M2,再将重组质粒pSIP409-pgsA'-NP-M2通过电转化的方法转入植物乳杆菌Lb.plantarum NC8中,制备重组菌NC8-p SIP409-pgsA'-NP-M2并诱导表达,最后通过流式细胞术、免疫荧光和免疫印迹技术验证。结果表明,重组菌NC8-pSIP409-pgsA'-NP-M2能够经诱导表达NP-M2融合蛋白,并且与兔源NP单克隆抗体和抗M2的小鼠血清具有反应原性。试验为后续研究禽流感广谱口服疫苗奠定了基础。

乳酸菌作为粘膜重组疫苗呈递载体的研究进展

乳酸菌是对人和动物具有多种益生功能的食品级微生物,被广泛地应用于食品、医药、生物技术等领域。乳酸菌的安全益生特性及乳酸菌基因表达系统研究取得的重大进展,使得重组乳酸菌黏膜疫苗成为研究的热点。乳酸菌作为黏膜免疫的蛋白呈递载体,可诱导机体产生有效的免疫反应和免疫耐受,具有巨大的发展潜力。

口服重组乳酸菌的药用研究与应用

目的围绕重组乳酸菌的药用优势、发挥药用效应的免疫学机制、影响因素、主要应用及其发展中面临的问题进行综述。方法分析和整理近年来国内外关于口服重组乳酸菌药用研究与应用的相关文献。结果与结论多种乳酸菌以其安全性、遗传可操作性及良好的定植能力成为口服药用蛋白在胃肠道发挥局部作用的潜在运载工具。近10年的动物试验表明,口服重组乳酸菌具有明显的药用价值,目前该项研究已进入人类临床实践阶段。虽然重组乳酸菌口服剂型的研发仍存在技术瓶颈,但其应用前景和潜在的商业价值不可估量。

猪白细胞介素-2重组乳酸菌对小鼠小肠结构影响的研究

为了评价猪白细胞介素-2重组乳酸菌(porcine interleukin-2 recombinant lactic acid bacteria, PIL-2-RLAB)对小鼠小肠结构的影响,试验用磷酸缓冲液(PBS)、乳酸菌(LAB)、PIL-2-RLAB分别灌胃21只4周龄小鼠1周,记录各组小鼠体重增长变化并绘制增重曲线,颈椎脱臼法处理小鼠并取十二指肠进行H.E.染色制作组织切片,显微镜下观察肠绒毛形态变化,测量肠绒毛长度(深度),观察肠上皮细胞形态结构。结果表明:LAB和PIL-2-RLAB均可加快小鼠体重增长,显著促进肠绒毛生长(P<0.05),改善肠上皮细胞结构的完整性。说明PIL-2-RLAB有改善肠组织内部结构,增强机体免疫力的作用,或许可用于动物肠道疾病的防治。

重组猪抗菌肽乳酸菌的构建及其应用效果

为研制防治仔猪腹泻的无抗添加剂,本试验以乳酸菌为表达载体,重组猪β-防御素及PR-39抗菌肽,构建重组乳酸菌pNZ8148-β-PR-39、pNZ8148-β及pNZ8148-PR-39,并饲喂21日龄断奶仔猪。结果显示:仔猪基础日粮中添加重组乳酸菌可降低肠道中大肠杆菌数量(P<0.05);重组乳酸菌pNZ8148-β-PR-39可有效抑制仔猪肠道的金黄色葡萄球菌及肠球菌(P<0.05),仔猪腹泻率降低39.62%,腹泻指数降低33.07%,差异显著(P<0.05)。结果表明仔猪基础日粮中添加本试验构建的重组乳酸菌,能够显著提高仔猪的生产性能,降低肠道有害菌含量,并降低仔猪腹泻率。

表达鸡传染性法氏囊病毒VP2蛋白重组乳酸乳球菌的构建及其表达的优化

鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)的VP2蛋白是该病毒的主要抗原蛋白,为制备乳酸菌黏膜免疫口服疫苗,本研究采用乳酸乳球菌(L.lactis)及其Nisin诱导的表达系统,对VP2基因进行密码子优化,构建了表达IBDVVP2蛋白的重组乳酸乳球菌L.lactis/p NZ-VP2。经正交试验对诱导条件进行优化,重组VP2蛋白(r VP2)表达量比优化前明显提高,最终得到最佳诱导条件为:OD600nm=0.5开始诱导,Nisin终浓度为2 ng/m L,诱导时间为5 h,r VP2表达量达到最大值38μg/m L。经western blot检测,r VP2能够持续性表达并具有良好的抗原性。该重组乳酸菌的构建为进一步体内免疫实验奠定了基础。

过量表达乳酸脱氢酶的重组干酪乳杆菌构建及发酵性能

乳酸脱氢酶(LDH)是干酪乳酸菌(L.casei)合成L-乳酸途径中的关键酶,通过构建过量表达乳酸脱氢酶的重组干酪乳杆菌,提高干酪乳杆菌发酵产乳酸的能力。根据干酪乳杆菌乳酸脱氢酶的基因序列设计引物,PCR扩增获得乳酸脱氢酶基因(ldh),将其连接到乳酸杆菌穿梭质粒pMG36e,构建重组质粒pMG-ldh,电转入L.casei,利用红霉素MRS平板筛选阳性克隆,获得表达乳酸脱氢酶的重组菌L.casei pMG-ldh,SDS-PAGE和酶活分析结果表明成功表达了一个约37kD的乳酸脱氢酶蛋白,重组酶活力最高达95U/mL,较原始菌23U/mL提高了近3.1倍。为进一步提高其产乳酸能力,添加4mmol/L激活剂FBP和8mg/L烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)前体物烟酸,结果表明:重组菌L.caseipMG-ldh乳酸积累128.2g/L,生产强度达到3.04g/(L.h),较原始菌株L.casei分别提高了35%和53%,发酵周期缩短6h。

人金属硫蛋白在乳酸菌中的融合表达及其预防食源性镉污染的应用

目的：镉（Cd）是一种重要的环境污染物,其具有半衰期长、不能生物降解等特性使之易于在人体重要脏器中蓄积并对人身体健康造成不可逆的损伤。为此,减少镉的摄入,尤其是经胃肠道,是预防人体慢性镉中毒的有效方法。方法：构建以α-半乳糖苷酶作为筛选标记、表达金属硫蛋白融合蛋白（GST-SUMO-MT）的重组乳酸乳球菌MG1363/p M-GSMT。原子吸收光谱法分析重组乳酸菌对Cd^（2＋）和Zn~＋的结合能力。以灌胃方式,对雄性Sprague-Dawley大鼠每天口服不同剂量的重组乳酸菌（2×10~9~2×10^（11）CFU/d）及CdCl_2溶液[5mg/（kg·d）],连续处理56天。收集实验动物肝、肾、脑及睾丸,利用原子吸收光谱法检测这些脏器中镉离子的含量。生化分析检测血清中尿素及丙氨酸转氨酶的含量。石蜡切片及苏木精-伊红染色分析各组织的病理变化。结果：获得不含抗生素抗性的重组乳酸菌MG1363/p M-GSMT,其吸附Cd^（2＋）、Zn^（2＋）能力比对照组分别提高3.52倍和1.60倍。动物实验结果显示,镉能在肝、肾、脑及睾丸中蓄积,并对这些器官造成明显的病理损伤。原子吸收光谱分析、血清生化指标及病理切片结果都显示,重组乳酸菌能有效降低胃肠道中镉的摄入,进而减少Cd^（2＋）在各脏器中的蓄积及对器官功能的损伤。结论：为预防人体食源性慢性镉中毒提供了一种有效的生物材料和使用方法。