乙酰胆碱酯酶基因重组腺病毒的构建及其对猫食管平滑肌细胞的影响

目的:利用AdEasy系统构建乙酰胆碱酯酶催化亚单位(AChET)重组腺病毒(AdAChET),并观察其对平滑肌细胞的影响. 方法:将质粒pEFbos/AChET扩增、酶切获得AChET cDNA 片段插入腺病毒穿梭载体质粒pAdTrack-CMV的巨细胞病毒(CMV)启动子下游,构建重组穿梭载体pAdTrack- CMV-AChET,线性化后与骨架载体AdEasy-1在细菌BJ5183内同源重组得到腺病毒质粒pAd AChET,经293 细胞包装后得到复制缺陷型重组腺病毒Ad AChET;将Ad AChET体外感染猫平滑肌细胞,以RT-PCR检测AChET 在平滑肌细胞的表达;同时测定胆碱酯酶活力. 结果:连接、重组后通过酶切和测序法筛选出pAd AChET; 经293细胞包装,3 d后观察到绿色荧光蛋白(GFP)明显表达,氯化铯梯度离心纯化最终获得约4×1013efu/L滴度的重组病毒;AdAChET体外感染平滑肌细胞3 d后,AChET 表达明显增加,乙酰胆碱酯酶活力较Ad GFP感染组和阴性对照组明显增加(0.546±0.048 vs 0.495±0.039,0.546±0.048 vs 0.501±0.037)(P均<0.01). 结论:利用新型腺病毒载体AdEasy系统可在短期内制备同时表达GFP和AChET的重组腺病毒Ad AChET;Ad AChET 体外感染平滑肌细胞可显著提高AChET的表达,这将为基因治疗贲门失弛缓症提供新的手段.

家蚕乙酰胆碱酯酶基因bmace在毕赤酵母GS115中的表达及其分析

【目的】构建表达家蚕乙酰胆碱酯酶(BmAChE)的毕赤酵母菌株,实现BmAChE在毕赤酵母中分泌表达并对其活性进行分析。【方法】从家蚕头部提取总RNA,经RT-PCR反转录成cDNA,通过PCR扩增出家蚕乙酰胆碱酯酶基因bmace并进行序列测定。采用PCR及重叠延伸PCR去除原bmace中的信号肽和疏水肽,并对序列中存在的2个A+T富含区进行同义密码子替换的改造。将改造后的bmace与表达载体pPIC9K连接,转化毕赤酵母GS115,甲醇诱导表达。SDS-PAGE和Western blotting鉴定重组蛋白,以Ellman法测定酶活力,毒扁豆碱和有机磷及氨基甲酸酯类农药抑制试验分析重组BmAChE(rBmAChE)的生物活性。【结果】改造后的bmace经重组毕赤酵母菌株分泌表达了1个分子量约为70 kD的蛋白,具有AChE活性,酶比活力约为1 187 U.mg-1。抑制试验显示,该rBmAChE能够被毒扁豆碱强烈抑制,并且可被皮蝇磷等10种有机磷农药和克百威等5种氨基甲酸酯类农药抑制,最低抑制浓度IC50值可达2.78×10-10mol.L-1。【结论】成功构建分泌表达BmAChE的毕赤酵母菌株,其表达了具有良好活性的rBmAChE,可用于进一步制备有机磷及氨基甲酸酯类农药快速检测分析制剂。

重组乙酰胆碱酯酶的表达及其分子进化研究进展

乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase,AChE)是酶抑制法检测农药残留的核心试剂。但天然提取的AChE存在含量低、纯化困难、稳定性差等不足,因此,高性能的重组AChE制备成为研究学者关注的热点。文中综述了重组AChE的表达、和分子进化等方面的研究成果,并指出酶定向进化策略与表面展示技术结合是重组AChE活性改造的未来趋势。

重组人乙酰胆碱酯酶的表达及其抑制剂的筛选（英文）

本研究旨在表达重组人乙酰胆碱酯酶(recombinant human acetylcholinesterase,rhAChE)并应用于乙酰胆碱酯酶抑制剂筛选研究。利用质粒pCMV-AChE瞬时转染HEK293细胞,分泌表达rhAChE。考察rhAChE的酶活性:以碘化硫代乙酰胆碱(ATCh)为底物进行酶底物动力学研究获得rhAChE的米氏常数Km,以多奈哌齐(donepezil)为抑制剂进行酶抑制作用动力学研究获得Ki、Ki’等参数。利用rhAChE测定新化合物的IC50值,评价新化合物的抑制活性,同时将研究结果与文献报道的提取大鼠AChE的抑制活性进行比较。结果测得rhAChE的Km为151.9μmol·L-1,多奈哌齐对rhAChE的抑制作用为竞争性和非竞争性结合的混合类型(Ki=16.03 nmol·L-1,Ki’=18.36 nmol·L-1),rhAChE可应用于抑制剂筛选研究。

重组人乙酰胆碱酯酶体外表达制备及其相关小分子活性筛选

目的:建立重组人乙酰胆碱酯酶(rhAChE)抑制剂体外筛选模型,并应用该模型对中药单体进行抑制剂的初步筛选。方法:运用pCMV-AChE表达质粒转染HEK293细胞,通过DEAE-Sepharose FF柱纯化酶液,获得更高纯度和活性的纯化酶,并建立其活性检测方法,同时结合SDS-PAGE及Western blot验证模型成功与否;以AChE的可逆性抑制剂多奈哌齐为阳性药,运用该模型探究小檗碱、血根碱和蛇根碱对AChE的影响。结果:纯化液比活力为15.93 U·mg-1,纯化倍数为9.63,酶活回收率为56%;Western blot结果显示在68×103 g·mol^(-1)附近出现明显的rh ACh E的单一条带;测得纯化后rh ACh E的IC50为5.0 nmol·L^(-1),明显低于纯化前(14 nmol·L^(-1));3个不同的化合物对rhAChE分别表现出不同程度的抑制作用,其中小檗碱的IC50接近多奈哌齐。结论:SDS-PAGE、Western blot以及多奈哌齐的阳性结果显示利用pCMV-AChE转染的HEK293细胞成功构建rhAChE抑制剂体外筛选模型,并成功运用于中药单体药物的初筛。

基于重组乙酰胆碱酯酶的有机磷和氨基甲酸酯类农药残留快速检测方法的应用验证

目的:探讨基于重组乙酰胆碱酯的酶抑制率法快速检测有机磷和氨基甲酸酯类农药(以下简称农药)残留的效果。方法:采用快速检测法和气相色谱法(农业部标准,NY/T761-2004)对19种常见农药的标准品和16种农药加标蔬菜进行平行试验。结果:15种常见农药标准品检测限小于0.01 mg/L,16种农药加标蔬菜快速检测的总体准确率为87.5%。结论:与传统快速检测方法相比,基于重组乙酰胆碱酯酶的农药快速检测方法灵敏度较高,稳定性较强,可广泛应用于蔬菜中农药残留的快速检测。