基于报告基因的重组人促卵泡激素Fc融合蛋白生物学活性测定方法研究

目的:利用转基因细胞法建立重组人促卵泡激素Fc融合蛋白(rhFSH-Fc)生物学活性检测方法。方法:利用CHO-K1-FSHR-CRE-Luc转基因细胞,按一定细胞密度种板,培养16~20 h后吸弃培养基,将rhFSH-Fc倍比稀释加入细胞板,药物作用一段时间后加入荧光素酶检测试剂,通过荧光素酶检测系统对rhFSH-Fc进行生物性活性检测,并对各试验条件参数优化及进行方法学验证。结果:rhFSH-Fc在该方法中存在量效关系且符合四参数曲线方程,R;大于0.99;方法优化后确定细胞种板密度为5×10^(5)个·mL^(-1),rhFSH-Fc稀释起始浓度为750 ng·mL^(-1),1∶5倍的稀释倍数,诱导时间为4 h,样品稀释液为DMEM/F12K+10%FBS。该方法具有良好的专属性,9次独立日间、日内精密度检测RSD均小于5%,5个不同稀释组回收率样本经6次测定,相对效价分别为(51±2.00)%、(78±2.05)%、(94±2.23)%、(124±3.46)%、(141±4.45)%;对应回收率平均值分别为(101±3.94)%、(104±3.00)%、(94±2.24)%、(99±2.68)%、(94±3.03)%,RSD均小于4%。结论:本研究利用转基因细胞成功建立rhFSH-Fc生物学活性测定方法,该方法操作简便,重复性好,准确性高,可用于rhFSH-Fc产品的常规检测。

重组人促卵泡激素(rhFSH)肽图分析方法研究

目的建立重组人促卵泡激素(rh-FSH)的标准肽图分析方法。方法通过超滤、透析、冷冻干燥法富集制备rh-FSH对照品。通过尿素变性、二硫苏糖醇(DTT)还原、碘乙酸酰基化制备供试品溶液。采用N型-糖苷酶F(PNGaseF)酶解去除rh-FSH糖侧链,经SDS-PAGE验证切糖结果后,用胰蛋白酶水解,酶解所得肽段通过RP-HPLC分析,得到rh-FSH肽图。结果利用国外原研厂rh-FSH制剂富集制备的rh-FSH结构完整,可用作rh-FSH肽图分析的对照品。国产样品的肽图谱与对照品一致。结论建立的肽图分析方法可作rh-FSH产品的结构确证。

重组促卵泡激素在哺乳动物辅助生殖中的应用研究进展

垂体促卵泡激素(FSH)是卵泡生长发育、颗粒细胞增殖及类固醇合成、精子生成等生殖生理活动必需的糖蛋白激素(GPH),在人类和动物辅助生殖中扮演着非常重要的角色。天然FSH的半衰期很短,单次使用的有效血药浓度远不足以维持哺乳动物的卵泡周期,并且天然FSH的来源越来越受限。因此,重组FSH(rFSH)药物的开发迫在眉睫,rFSH不仅有助于提高繁殖效率,还可减少频繁给药给人类医学临床患者带来的精神压力和给动物造成的应激。本文主要针对近几年国内外rFSH的研究,如FSH的糖基化修饰、新生儿可结晶片段(Fc)受体(FcRn)介导及聚乙二醇(PEG)化,以及其对雌性卵巢调控功能进行综述,旨在为人类与动物的辅助生殖提供参考。

rhEPO-Fc融合蛋白的表达、纯化及质量研究

用无血清培养基培养分泌表达rhEPO-Fc融合蛋白的工程细胞株MY06(CHO细胞),收集发酵培养上清,通过离心、过滤、亲和层析、离子交换层析、分子筛等方法对目的蛋白进行纯化,通过lowry法、SDS-PAGE、Western-blot、HPLC、ELISA及IEF等方法研究目的蛋白质量,以建立rhEPO-Fc融合蛋白的发酵、纯化工艺,并探寻该融合蛋白的质量检测方法。通过该工艺,rhEPO-Fc蛋白表达量高达2g/L,蛋白纯化得率达45%以上,纯度可达98%以上,相对分子质量约为60kDa,t1/2长达38h,免疫印迹证明具有天然EPO的免疫原性。研究结果表明该生产工艺可获得rhEPO-Fc的高效表达,纯化得率高,质量检验方法稳定可靠,适用于大规模生产。

一种新型长效重组绒毛膜促性腺激素的表达、活性和药代动力学研究

目的 构建含有Fc片段的绒毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin,hCG）新型长效重组hCG-Fc融合蛋白,可显著延长其在血液中的半衰期,有利于提高患者用药依从性.方法 首次将Fc DNA片段有序连接到hCG基因3＇端,构建hCG-Fc表达载体并将其稳定表达在哺乳动物细胞,通过无血清悬浮细胞培养和基于亲和层析的蛋白纯化,制备了新型重组hCG-Fc融合蛋白.检测其分子量、ELISA免疫活性和体内生物活性,并测定其在大鼠体内血循环半衰期.结果 重组融合蛋白分子量与理论推断值相当,ELISA活性为2 965 IU/mg,体内生物活性为2 288 IU/mg,消除半衰期为174 h.结论 hCG-Fc融合蛋白构建表达成功,且具有显著的体内外活性,药代动力学分析显示hCG-Fc重组融合蛋白半衰期是重组hCG的近6倍.这种新型长效融合蛋白在临床上可大大减少注射次数,提高患者用药依从性,具有显著的社会和经济效益.

长效重组人生长激素-Fc融合蛋白纯化工艺的建立

目的建立长效重组人生长激素-Fc(recombiant human growth hormone-Fc,rhGH-Fc)融合蛋白的纯化工艺。方法rhGH-Fc融合蛋白细胞培养液经离心、低pH处理、过滤、浓缩预处理后,再经Protein-A亲和层析、CM阳离子交换层析、Q HP阴离子交换层析进行纯化,同时检测rhGH-Fc融合蛋白的蛋白含量、纯度、等电点及宿主蛋白、宿主DNA、Protein-A残留量等指标。结果Protein-A亲和层析、CM阳离子交换层析、Q HP阴离子交换层析纯化产物的蛋白含量分别为145、132、92.4 mg,纯度分别为95.40%、95.90%和99.19%,宿主蛋白残留量分别为2500、864和71 ng/mg,宿主DNA残留量分别为329、0.56和0.12 ng/mg,Protein-A残留量分别为24.5、3.2和0 ng/mg。rhGH-Fc融合蛋白相对分子质量约97300,等电点范围为5.5~6.5,可与鼠抗人生长激素(human growth hormone,hGH)抗体发生特异性结合。结论成功建立了rhGH-Fc融合蛋白的纯化工艺,该工艺的纯化产物回收率及纯度均较高,本实验为rhGH-Fc融合蛋白的大规模生产奠定了理论基础。

表达长效重组人生长激素-Fc融合蛋白的CHO细胞培养工艺的优化及放大

目的优化表达长效重组人生长激素-Fc(recombiant human growth hormone-Fc,rhGH-Fc)融合蛋白的CHO细胞培养工艺,并进行初步工艺放大。方法采用7 L生物反应器培养表达rhGH-Fc融合蛋白的CHO细胞,操作参数:转速200 r/min,温度37℃,pH 7.2±0.1,溶氧值(DO)40%。通过改变对数增长期的pH(7.2±0.1降至6.9±0.1)及平台期降温幅度(37℃降至30及33℃),检测培养过程中细胞密度、细胞活率、培养液渗透压、葡萄糖及乳酸水平、以蛋白表达量为指标,优化7 L生物反应器培养工艺。应用优化的最佳工艺进行14 L线性放大,通气量分别设置为0.5、0.1及0.03 SLPM,检测蛋白表达量。结果7 L生物反应器培养工艺最佳pH为6.9±0.1,最佳温度为33℃,该工艺下蛋白表达量高达1200 mg/L;14 L生物反应器培养工艺最佳通气量为0.03 SLPM,该工艺下蛋白表达量为880 mg/L。结论成功优化了表达rhGH-Fc融合蛋白的CHO细胞7 L生物反应器的培养工艺,并实现了14 L生物反应器的放大,本实验为后续rhGH-Fc融合蛋白的大规模生产奠定了基础。

重组人生长激素Fc融合蛋白工程细胞染色体核型分析

目的分析重组人生长激素Fc融合蛋白工程细胞(rhGH-CHO细胞)染色体核型。方法采用0. 1μg/m L秋水仙碱处理分裂中期的细胞,经固定、染色,制片观察,选取染色体形态及分散度较好的视野拍照。应用Image-ProPlus 6. 0(IPP)软件打开图片,利用手动测量工具(manual measurements)随机测量50个2n=22的CHO-k1和rhGH-CHO细胞中染色体长臂和短臂长度,计算各染色体的相对长度(各染色体与最长染色体长度的比值)及短臂/长臂的比值,并绘制染色体核型的B-Spline特征曲线。结果 rhGH-CHO和CHO-k1细胞的染色体数目均为22条,且染色体核型特征曲线一致。结论 rhGH-CHO细胞来源于CHO-k1细胞,且未受其他细胞污染。

长效重组人促卵泡激素主要功效的对比研究

目的：评价并比较生物类似药候选药长效重组人促卵泡激素（rh FSH-CTP）与参照药Elonva的功能差异,即对幼龄大鼠体内主要药效学作用的相似性。方法：生物活性测定按中国药典方法进行;药效学研究以未成年4-5周龄,体重70-90 g的SD雌性大鼠研究其超排卵作用。结果：rhFSH-CTP注射液的生物效价为453 IU·支-1,与参照药Elonva体内活性相当,两者差异很小;其超排卵作用相比于阴性对照组（空白组）卵巢系数、卵子数、组织病理学总评分等指标显著增大（p〈0.05）,大鼠血清激素水平即雌二醇（E2）、黄体激素（LH）、促卵泡激素（FSH）、孕酮（P）等都有不同程度增加,尤其E2增加显著（p〈0.05）;各指标与Elonva间的差异无显著性意义（p〉0.05）。结论：生物类似药候选药rhFSH-CTP批号20140901的制剂,具有生物活性和促进卵泡发育成熟超排卵的长效作用,与参照品Elonva活性和药效相似。

重组人促卵泡激素氧化亚基分析方法研究

目的:研究建立重组人促卵泡激素(rhFSH)氧化亚基分析方法,制备稳定的氧化亚基分析用系统适用性溶液。方法:通过加入过氧化氢氧化破坏重组人促卵泡激素,后加入甲硫氨酸终止该氧化作用,制备系统适用性溶液。采用RP-HPLC法分离分析重组人促卵泡激素氧化亚基。使用C_(4)色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm);流动相A为0.2 mol·L^(-1)磷酸二氢钾缓冲液(pH 2.5),流动相B为80%乙腈;流速1 mL·min^(-1);柱温30℃;检测波长210 nm;梯度洗脱(0~10 min,82%A→74%A;10~25 min,74%A→60%A;25~26 min,60%A→20%A;26~56 min,20%A;56~56.1 min,20%A→82%A;56.1~75 min,82%A)。结果:加入甲硫氨酸可有效终止氧化作用,制备得到稳定的系统适用性溶液。优化建立的氧化亚基分析方法专属性良好,重复性(RSD=0.22%)、色谱柱耐用性(RSD=3.21%)、36 h内溶液稳定性(RSD=0.65%)结果良好。9批样品中氧化亚基含量范围为0.687%~1.001%。结论:优化建立的氧化亚基分析方法可对重组人促卵泡激素中的氧化亚基进行准确定量,能够用作重组人促卵泡激素的质量研究和放行检验;研究制备的系统适用性溶液可准确地对氧化亚基进行峰定位。

人生长激素Fc融合蛋白电荷异质性全柱成像毛细管等电聚焦电泳分析方法的建立及验证

目的建立全柱成像毛细管等电聚焦电泳(image capillary isoelectric focusing,iCIEF)方法分析重组人生长激素(recombinant human growth hormone,rhGH)Fc融合蛋白(Fc-rhGH)的电荷异质性,并对方法进行验证。方法通过对目标蛋白浓度、助溶剂(尿素)浓度、聚焦时间的优化建立Fc-rhGH的iCIEF分析方法。采用该方法与传统平板等电聚焦电泳(isoelectric focusing,IEF)同时分析目标蛋白,并比较分析结果;对建立的方法进行特异性、准确性、精密性、定量限(limit of quantitation,LOQ)、耐用性验证。结果优化后的方法为采用8 mol/L尿素、0.35%甲基纤维素(methyl cellulose,MC)、4%两性电解质、0.5%等电点标记物混合溶液为样品缓冲液,聚焦条件为:1500 V 1 min,3000 V 5.5 min。IEF不适用于分析Fc-rhGH原液的电荷异质性。采用优化的iCIEF进行分析,目标蛋白能明显区别于非相关蛋白,且空白试剂基线平稳;准确性验证回收率在90%~110%之间,线性范围为0.25~0.75 mg/mL(目标上样量的50%~150%);重复性验证中各异构体pI的RSD均小于0.3%,峰面积百分比RSD均小于5%;定量限为0.04 mg/mL;方法的样品保存时间耐用性、两性电解质pharmalyte 3-10耐用性和MC耐用性良好。采用该方法分析Fc-rhGH理化对照品的电荷异质性,可有效分离对照品的8个电荷异质体,pI范围在5.9~6.4。结论建立的iCIEF法具有良好的特异性、准确性、精密性、耐用性,比传统平板IEF更适合高效分析Fc-rhGH的电荷异质性,对Fc-rhGH及其他Fc融合蛋白的质量控制具有重要意义。

新型长效重组促卵泡素的纯化和性质及药代动力学研究

促卵泡素(Follicle-stimulating hormone,FSH)用于治疗男女不孕不育症,由于FSH的半衰期较短,需要频繁注射给药,因此制备长效FSH制剂一直是该类药物的研发方向。首次将来自绒促性素(human chorionic gonadotropin,HCG)中的羧基端肽(carboxy-terminal peptide,CTP)和人免疫球蛋白G2(immunoglobulin G2,IgG2)Fc片段变体(vFc)与单链FSH有序连接,通过基因工程和哺乳动物细胞培养技术实现了其在中国仓鼠卵巢细胞中的稳定表达,然后利用Protein A柱层析手段进行纯化,制备了新型重组FSH-CTP-vFc融合蛋白,同时分析了不同细胞培养时间表达的重组融合蛋白的理化性质和体内外活性。动物试验结果表明,纯化的FSH-CTP-vFc融合蛋白具有显著的体内生物活性,药代动力学分析显示该重组融合蛋白的半衰期是重组FSH的近10倍。这种新型长效重组FSH-CTP-vFc融合蛋白在临床上可大大减少注射次数和患者痛苦,提高患者用药依从性。