脂质体包裹的促甲状腺激素受体胞外段基因重组质粒免疫法构建小鼠甲状腺相关眼病动物模型的可行性

背景甲状腺相关眼病（TAO）是眼科临床常见的难治性疾病，发病率在眼眶疾病中居首位。目前对于TAO的研究缺乏可复制的动物模型，在疾病早期阶段难以获得眼眶组织，具体病因及确切的发病机制仍未得到阐明。要详细了解TAO的发病机制，探寻有效防治措施，关键在于建立适当的动物模型。目的采用脂质体包裹的促甲状腺激素受体（TSHR）胞外段基因重组质粒免疫同系雌性BALB／c小鼠，探讨该方法建立TAO动物模型的可行性。方法按照计算机随机分组方法将32只同系6～8周龄雌性BALB／c小鼠随机分为空白对照组、空质粒注射组、脂质体注射组和重组质粒注射组。分别于0、3、6周免疫各组小鼠，重组质粒注射组小鼠经双胫前肌和腹腔内分别注射阳离子脂质体包裹的pcDNA3．1＋／hTSHR28930txg和40μg；脂质体注射组小鼠分别经双胫前肌和腹腔内分别注射未包裹重组质粒的阳离子脂质体30μg和40μg；空质粒注射组小鼠分别经双胫前肌和腹腔内分别注射pcDNA3．1＋空质粒30μg和40μg；空白对照组小鼠未行任何干预。分别于初次免疫前及初次免疫后1、2、3、4个月测量各组小鼠的体质量，观察小鼠外眼表现。于初次免疫后17周末处死小鼠，取甲状腺及眼眶组织进行组织病理学观察；收集各组小鼠心脏血0．6～0．8ml，采用ELISA法测定小鼠血清总甲状腺素4（TT4）和促甲状腺激素（TSH）的质量浓度。结果重组质粒注射组6只小鼠12只眼出现眼球突出、眼睑肿胀和角膜溃疡。空白对照组、脂质体注射组、空质粒注射组小鼠随着时间的延长体质量逐渐增加，而重组质粒注射组小鼠体质量则逐渐下降，总体比较差异有统计学意义（F时间=3．838，P=0．023），不同组间小鼠体质量总体比较差异有统计学意义（F分组=3．425，P=0．028），其中注射后2、3、4个月重组质粒注射组小鼠体质量明显低于空白对照组、空质粒注射组和脂质体注射组，差异均有统计学意义（均P〈O．05）。空白对照组、脂质体注射组、空质粒注射组和重组质粒注射组小鼠血清TT4质量浓度分别为（7．75±1．00）、（7．96±0．76）、（6．76±1．10）和（4．43±2．88）μg／dl，TSH质量浓度分别为（6．36±2．58）、（4．83±3．96）、（6．63±1．71）和（1．60±1．76）ng／ml，总体比较差异均有统计学意义（F=7．150，P〈0．001；F=5．521，P〈O．01），其中重组质粒注射组小鼠血清中TT4和TSH质量浓度均明显低于空白对照组、脂质体注射组、空质粒注射组，差异均有统计学意义（均P〈O．05）。组织病理学检查显示，6只重组质粒注射组小鼠甲状腺出现淋巴细胞浸润，15只眼小鼠眼眶组织出现眼眶内脂肪组织增生、淋巴细胞及肥大细胞浸润、透明质酸沉积以及眼外肌肌纤维肿胀、变性和断裂，并伴有炎性细胞浸润。结论采用脂质体包裹的TSHR胞外段基因重组质粒免疫同系雌性BALB／c小鼠建立TAO动物模型是一种可行、有效的方法，该模型与人TAO的病理组织学特征相似，成模率高。

脂质体包裹人促甲状腺激素受体胞外段基因真核表达质粒的构建

目的:构建阳离子脂质体包裹的人促甲状腺激素受体胞外段基因真核表达质粒。方法:PCR扩增穿梭质粒PHMCMVTSHR289目的基因并连接于真核表达质粒pcD NA3.1+上,重组质粒pcD NA3.1+/TSHR289采用酶切及测序法鉴定。阳离子脂质体包裹重组质粒pcD NA3.1+/TSHR289。结果:重组质粒pcD NA3.1+/TSHR289用Hind III酶切后产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳检测显示出现512bp条带。正向测序发现AAC突变为AAT,为同义突变。反向测序发现GCG突变为GCT,亦为同义突变。阳离子脂质体与重组质粒的体积质量比例为3∶1。结论:酶切及测序鉴定重组质粒pcD NA3.1+/TSHR289构建成功。

用重组hTSHR胞外段测定女性AITD患者TRAb的研究

目的应用重组人促甲状腺素受体胞外段(hTSHRecd)蛋白在自身免疫性甲状腺病(AITD)患者中用以间接酶联免疫吸附法(ELISA)检测TSH受体抗体(TRAb),建立一种简便快捷、敏感性及特异性均高的新的TRAb测定方法。方法病例组:女性,Graves甲亢(GD)患者59例,其中初诊23例;原发性甲状腺功能减退患者63例。对照组:非AITD甲状腺病(甲状腺囊肿或腺瘤,甲状腺功能正常)43例;正常对照50例。将重组hTSHRecd蛋白稀释成10μg/mL,包被酶标板,利用间接ELISA法测定上述各组样本血清TRAb,以放射受体分析(RRA)检测法为对照。结果间接ELISA法测定TRAb,各组OD450值分别为:正常对照组0.27±0.12,非AITD对照组0.32±0.26,GD甲亢组0.96±0.78,甲减组0.48±0.39。GD甲亢及甲减组与两个对照组相比均有显著性差异(GD甲亢t_1=6.79,t_2=6.30;甲减t1=4.27,t_2=3.26,均P<0.01)。用ELISA法和RRA法在AITD患者组中检测TRAb的阳性率分别为:GD甲亢组76.27%、81.36%,经比较无显著性差异(x^2=0.57,P>0.05);初诊GD甲亢组86.96%、91.30%,经比较无显著性差异(x^2=0.00,P>0.05);甲减组34.92%、39.68%,经比较无显著性差异(x^2=0.57,P>0.05)。用两种方法测得的TRAb活性值有相关性(r=0.577925,P<0.05)。结论 重组hTSHRecd蛋白与AITD患者血清有良好的反应性。间接ELISA法检测高效、简便、费用低,无同位素污染,在作为临床常规检验中优于RRA。

人促甲状腺素受体膜外区基因克隆及真核表达

目的克隆人促甲状腺激素受体胞外段基因,构建重组真核表达质粒,获得具有免疫学活性的纯化重组蛋白。方法应用RT-PCR技术从人甲状腺组织得到TSHR膜外区cDNA,插入真核表达载体pcDNA3.1(+),转染CHO细胞,RT-PCR鉴定基因转录,用免疫细胞化学染色法和Western Blot鉴定表达蛋白。结果经测序证实筛选得到的重组体中存在序列正确的TSHR膜外区基因,表达蛋白具有免疫活性。结论成功克隆了人促甲状腺素受体膜外区基因和构建了真核表达载体,并将其在真核细胞中成功表达。

柯萨奇-腺病毒受体基因的原核表达和多克隆抗体制备

目的利用原核基因工程克隆表达柯萨奇-腺病毒受体(CAR)胞外段,并制备多克隆抗体。方法从HeLa细胞中抽提总RNA,通过RT-PCR获得编码CAR胞外段的cDNA,与pQE31质粒连接,构建表达型重组质粒,测序证实后诱导表达,经Ni-NTA柱亲和纯化后,免疫新西兰兔,ELISA检测抗血清滴度。结果重组质粒转化的大肠杆菌M15经IPTG诱导表达及亲和纯化后得到滴度较高的融合蛋白,SDS-PAGE和Western blot显示其分子量约为26 kd,具有特异的抗原性,主要以包涵体形式存在于菌体中。纯化的融合蛋白免疫新西兰兔后产生的抗体,经ELISA检测抗体滴度>1:32 000。结论CAR胞外段基因的克隆表达和多克隆抗体的制备,为进一步研究该受体在以腺病毒载体为基础的基因治疗中的作用及柯萨奇病毒的致病机制奠定了基础。

人TSHR A亚单位重组腺相关病毒2/9载体的构建及鉴定

目的构建人促甲状腺素受体(TSHR)A亚单位重组腺相关病毒2/9杂合载体(rAAV2-9-hTSHR289-IRES-ZsGreen),为研究格雷夫斯病建立理想动物模型和探索基因预防提供更佳手段。方法以 Eco RⅠ和 Bam HⅠ将腺相关病毒骨架质粒 pAAV-IRES-ZsGreen和含hTSHR289的pDC315质粒双酶切,回收酶切病毒骨架质粒及目的片段进行连接,产物转化JM109感受态细菌,获取重组腺相关病毒骨架质粒pAAV-hTSHR289-IRES-ZsGreen。经酶切电泳、测序鉴定后,将pAAV-hTSHR289-IRES-ZsGreen、辅助质粒pHelper、包装质粒pAAV-2/9(AAV2-Rep,AAV9-Cap)采用磷酸钙法转染293AAV细胞系,获取大量rAAV2/9-hTSHR289-IRES-ZsGreen,经纯化后荧光显微镜下观察其包装效率,rQ-PCR法测定病毒滴度。将rAAV2/9-hTSHR289-IRES-ZsGreen感染HEK293细胞,ELISA法检测不同时间点hTSHR289蛋白表达水平。结果重组腺相关病毒骨架质粒pAAV-hTSHR289-IRES-ZsGreen经双酶切及测序鉴定,质粒构建正确;荧光显微镜下观察显示转染293AAV细胞72 h,病毒包装效率达92%~94%,rQ-PCR法测定的rAAV2/9-hTSHR289-IRES-ZsGreen病毒滴度为1×10^13 vg/mL;ELISA法显示rAAV2/9介导的 hTSHR289 蛋白表达96 h明显高于72 h及48 h。结论成功构建rAAV2/9-hTSHR289-IRES-ZsGreen重组腺相关病毒载体并能有效转染和表达。

人TSHR A亚单位重组腺相关病毒体内外表达研究

目的探讨人TSHR A亚单位重组腺相关病毒(rAAV2/9-hTSHR289-IRES-ZsGreen)能否在小鼠胚胎成纤维细胞(NIH3T3)及小鼠体内表达及其表达效率。方法以rAAV2/9-hTSHR289-IRES-ZsGreen感染NIH3T3,Western blotting检测目的基因蛋白表达;分别以不同剂量rAAV2/9-hTSHR289-IRES-ZsGreen注射雌性BALB/c小鼠,免疫荧光法检测TSHR A亚单位蛋白在各个器官的表达,免疫放射法测定血清TSHR抗体(TRAb)滴度。结果感染rAAV2/9-hTSHR289-IRES-ZsGreenNIH3T3细胞48 h及72 h后均有目的蛋白表达,与24 h相比较明显增高,差异有统计学意义(P<0.05);荧光显微镜下可见腿部骨骼肌、心肌、肝脏、脾脏有不同程度的TSHR289表达;放免法测定结果显示,注射剂量越大,血清TRAb抗体滴度越高,但只有高剂量和对照组之间有统计学差异(P<0.05)。中剂量和高剂量肌内注射在第4、8、12周小鼠体内均有抗体反应,但以第4周最强,4~8周逐渐减弱,抗体持续时间可达12周。结论rAAV2/9-hTSHR289-IRES-ZsGreen可在体外及小鼠体内高效表达,并具有较强免疫原性,可能成为制备Graves病模型的一种重要手段。

BALB/c小鼠格雷夫斯病模型靶向TSHR和ICAM-1治疗的研究

目的:探讨靶向促甲状腺激素受体(TSHR)和细胞间黏附分子-1(ICAM-1)治疗格雷夫斯病(GD)的新方法。方法:设计合成TSHR的小干扰RNA(siRNA)及ICAM-1单克隆抗体(mAb)。30只GD模型鼠按随机数字表法分为siRNA治疗组、ICAM-1 mAb治疗组及未治疗组,另取10只正常小鼠作为空白对照。治疗前、后测定小鼠血清甲状腺素(T_(4))、促甲状腺激素(TSH)、TSH受体刺激性抗体(TSAb)、TSH刺激阻断性抗体(TSBAb)水平,治疗结束后测定各组小鼠体质量、心率,评估甲状腺摄取^(99)Tc^(m)O_(4)^(-)能力、甲状腺大小及病理变化。采用两独立样本t检验、配对t检验及单因素方差分析处理数据。结果:3次治疗后,siRNA组、ICAM-1 mAb组小鼠体质量均低于正常小鼠(F=3.50,P=0.025),心率均低于未治疗组GD模型鼠(F=24.73,P<0.001),其中siRNA组心率下降明显,接近正常小鼠。3次治疗后,siRNA组、ICAM-1 mAb组小鼠血清T_(4)[(27.58±1.94)、(27.24±3.50)μg/L]、TSAb[(331.44±43.38)、(275.16±45.80)mU/L]、TSBAb[(13.94±1.11)、(14.59±1.02)mU/L]水平均较治疗前明显下降[T_(4):(65.71±6.89)、(70.84±8.46)μg/L,TSAb:(457.33±45.85)、(443.91±42.32)mU/L,TSBAb:(15.83±5.92)、(17.05±6.16)mU/L;t值:4.45~10.87,均P<0.05],2组小鼠血清TSH水平[(0.13±0.05)、(1.46±0.34)mU/L]均较治疗前明显上升[(0.04±0.05)、(0.06±0.03)mU/L;t值:-2.22、-5.87,P值:0.007、<0.001],ICAM-1 mAb组小鼠TSH升高幅度及TSAb降低幅度高于siRNA组(t值:1.03、-1.63,P值:0.002、0.031)。治疗后siRNA组、ICAM-1 mAb组小鼠均见甲状腺部分腺叶摄取^(99)Tc^(m)O_(4)^(-)能力减低,相应腺叶肿大程度缩小。治疗组小鼠甲状腺病理可见甲状腺滤泡吸收空泡减少,胶质稀薄现象有所改善。小鼠心、肝、肾病理未见明显损伤。结论:靶向TSHR的siRNA及ICAM-1 mAb均对GD模型鼠有治疗作用,在控制心率方面siRNA效果更好,在升高TSH及降低TSAb方面ICAM-1 mAb效果更好。上述治疗方法安全、有效,可以为GD的靶向治疗提供新思路。