重组人内抑素对佐剂性关节炎大鼠滑膜细胞增殖及产生细胞因子的影响

目的观察重组人内抑素对体外培养佐剂性关节炎大鼠滑膜细胞的增殖功能及产生细胞因子的影响,探讨其治疗佐剂性关节炎的作用机制。方法采用弗氏完全佐剂(CFA)诱导的佐剂性关节炎(AA)大鼠模型,用足容积法测量关节肿胀度;采用collagenasetypeⅡ消化法分离、培养滑膜细胞,MTT法检测重组人内抑素体内用药对滑膜细胞增殖的影响;放免法检测滑膜细胞上清液中IL-1β、TNF-α的含量。结果CFA致炎后d10,AA大鼠出现继发性炎症,此时皮下注射重组人内抑素(1·25,2·5,5mg·kg-1),连续7d,对照组于d10给予MTX(1·0mg·kg-1)。各剂量组能明显抑制AA大鼠的继发性足肿胀;重组人内抑素体内用药可明显减少AA大鼠滑膜细胞数量,抑制滑膜细胞的增殖,并呈剂量依赖关系;各剂量组均可明显抑制AA大鼠滑膜细胞产生过高的IL-1β和TNF-α。结论重组人内抑素抑制AA大鼠滑膜细胞过度的增殖及过高的细胞因子是其治疗AA的途径之一。

重组人内抑素对兔耳创面瘢痕组织血管内皮生长因子、转化生长因子-β_1和碱性成纤维细胞生长因子表达的影响

目的观察重组人内抑素(rh Endostatin)对兔耳创面瘢痕增生及血管内皮生长因子(VEGF)、转化生长因子β1(TGF-β1)和碱性成纤维细胞生长因子(b FGF)表达的影响,探讨rh Endostatin抑制瘢痕增生的分子机制。方法健康新西兰大耳白兔20只,均分为正常对照组、模型组、生理盐水(NS)对照组、rh Endostatin(5 g/L)治疗组和醋酸曲安奈德(TA,40 g/L)对照组;除正常对照组外其余各组均进行增生性瘢痕动物模型的复制,在兔耳腹侧面制作1cm×1cm大小创面。术后第28天,rh Endostatin治疗组瘢痕皮内注射相应浓度rh Endostatin(100μl),NS对照组注射等量生理盐水,隔日1次,共6次;TA对照组瘢痕块内注入相应浓度曲安奈德(100μl),每周1次,共2次;模型组术后不接受处理。术后第47天摄片并收集瘢痕及正常皮肤标本,应用免疫组织化学方法检测VEGF、TGF-β1和b FGF的表达。结果形态学观察结果显示,术后第47天rh Endostatin治疗组瘢痕皮肤色泽变浅,变软变平,体积减小,与模型组和NS对照组比较有明显差异;免疫组织化学检测结果可见,与模型组和NS对照组相比,rh Endostatin治疗组VEGF和TGF-β1蛋白表达减少,b FGF表达增加,差异均具有统计学意义(P<0.01)。结论 rh Endostatin能有效抑制兔耳创面瘢痕增生,其机制可能与rh Endostatin影响VEGF、TGF-β1和b FGF蛋白的表达有关。

重组人内抑素对佐剂性关节炎大鼠滑膜组织血管内皮细胞生长因子表达的影响

目的:观察重组人内抑素对佐剂性关节炎大鼠滑膜组织血管内皮细胞生长因子(vascular endo-thelial cell growth factor,VEGF)的表达及其作用。方法:采用弗氏完全佐剂(Freund’s complete adjuvant,CFA)诱导的佐剂性关节炎(adjuvant-induced arthri-tis,AA)大鼠模型,用足容积法测量关节肿胀度;免疫组织化学法检测血管内皮细胞生长因子的表达及其对微血管密度的影响。结果:弗氏完全佐剂致炎后d 10,佐剂性关节炎大鼠出现继发性炎症,皮下注射给予不同剂量的重组人内抑素(1.25、2.5、5 mg.kg-1),连续7 d,对照组于d 10给予氨甲喋呤(Methotrexate,MTX,1.0 mg.kg-1)。重组人内抑素各剂量组能明显抑制AA大鼠的继发性足肿胀,重组人内抑素各剂量组可不同程度减少AA大鼠关节滑膜组织高表达的VEGF,还可使滑膜组织的微血管密度减少。结论:重组人内抑素可显著抑制AA大鼠滑膜组织VEGF的表达及微血管密度,该作用可能与抑制血管翳的生成及减少滑膜细胞表面VEGF的表达有关。

重组人内抑素对佐剂性关节炎大鼠滑膜组织凋亡相关基因表达的影响

目的:观察重组人内抑素(rh-end)对佐剂性关节炎大鼠滑膜组织p53、fas和bcl-2基因表达的影响。方法:采用SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法,定量检测该药对佐剂性关节炎大鼠滑膜组织p53、fas和bcl-2 mRNA表达的影响。结果:与模型组相比,rh-end治疗组大鼠滑膜组织fas和bcl-2 mR- NA表达水平增加,p53 mRNA表达水平降低,差异有统计学意义(P<0.01)。结论:rh-end可经fas介导诱导佐剂性关节炎大鼠滑膜细胞凋亡,且不依赖于p53,不能被bcl-2所抑制。

重组人内抑素对佐剂性关节炎大鼠关节软骨酸敏感离子通道的影响及其保护作用

目的观察重组人内抑素(rh-End)对佐剂性关节炎大鼠关节软骨酸敏感离子通道(ASICs)表达的影响,探讨其对关节软骨的作用。方法将大鼠随机分成正常组、AA模型组、rh-End 1.25、2.5、5.0mg·kg-1组和阿司匹林50mg·kg-1阳性对照组。弗氏完全佐剂(CFA)致佐剂性关节炎(adjuvant-induced arthritis,AA)后d10,大鼠出现继发性炎症,此时皮下注射重组人内抑素,连续7d,对照组灌胃给阿司匹林;正常组与模型组给予等容量的无菌注射用水。光学显微镜观察关节病理变化,半定量RT-PCR方法检测rh-End对AA大鼠关节软骨ASICs和蛋白聚糖体mRNA的影响,Western blot方法检测rh-End对AA大鼠关节软骨ASICs蛋白的影响,免疫组织化学技术测定rh-End对AA大鼠关节软骨中的Ⅱ型胶原蛋白合成的影响。结果rh-End各剂量组能明显抑制AA大鼠关节软骨组织中的ASICs表达,并升高关节软骨基质成分Ⅱ型胶原蛋白和蛋白聚糖体mRNA表达量。结论重组人内抑素通过抑制ASICs的表达进而保护AA大鼠关节软骨。

重组人内抑素诱导佐剂性关节炎大鼠滑膜细胞凋亡的研究

目的以弗氏完全佐剂诱导的佐剂性关节炎(AA)大鼠为动物模型,观察重组人内抑素诱导AA大鼠滑膜细胞凋亡的作用。方法分离、培养滑膜细胞,噻唑蓝(MTT)比色法检测重组人内抑素体内用药对滑膜细胞增殖的影响;用缺口末端标记法(TUNEL)及流式细胞仪检测重组人内抑素对AA滑膜细胞凋亡的影响。结果AA大鼠表现为滑膜细胞异常增殖,rh-End(1.25、2.5、5.0mg·kg-1)体内治疗给药及rh-End6.25～50mg·L-1浓度范围体外给药可抑制AA大鼠成纤维样滑膜细胞的增殖反应。rh-End体内用药可诱导AA大鼠滑膜组织及细胞的凋亡,rh-End体外用药作用48h,AnnexinV/PI双染色法观察到大鼠AAFLS凋亡率为1.77%,rh-End(25mg·L-1)可诱导AA大鼠FLS的凋亡,其凋亡率为6.67%。结论rh-End可不同程度抑制FLS的增殖反应,并诱导其凋亡的发生,减轻AA大鼠增生性滑膜炎。上述结果提示炎症增生的滑膜细胞可能是rh-End的另一个作用靶点。

重组人内抑素的抗肿瘤活性

目的 观察重组人内抑素抗肿瘤活性及对血管内皮细胞增殖的抑制作用。方法 用人癌裸鼠移植性肿瘤及小鼠移植性肿瘤模型对重组人内抑素进行抗肿瘤药效学观察 ,用MTT法观察其对血管内皮细胞及肿瘤细胞增殖的抑制作用。结果 重组人内抑素 ,可明显抑制人胃癌BGC80 3和人乳腺癌B37裸鼠移植性肿瘤的生长 ,对小鼠肝癌H2 2实体瘤亦呈一定的抑制作用。MTT试验结果显示重组人内抑素可抑制人胎脐静脉血管内皮细胞ECV30 4的增殖 ,对人结肠癌HCT 8等肿瘤细胞的增殖无影响。结论 重组人内抑素具有较强的抗肿瘤作用 ,其作用机理可能与抑制血管内皮细胞增殖、抑制肿瘤新生血管形成有关。

重组人内抑素抑制创面瘢痕增生的实验研究

目的观察重组人内抑素(rhEndostatin)对兔耳瘢痕增生的抑制作用,探讨其部分作用机制。方法建立兔耳增生性瘢痕(HS)模型,瘢痕块内局部注射rhEndostatin(1.25、2.5、5 g/L),观察瘢痕大体形态及组织学变化,免疫组织化学检测瘢痕组织Ⅰ、Ⅲ型胶原表达,电镜观察瘢痕组织成纤维细胞凋亡。结果与模型组和生理盐水组比较,2.5 g/L和5 g/L rhEndostatin组瘢痕平坦,面积减小,质地变软,瘢痕增生指数降低(P<0.05);微血管密度降低(P<0.05);Ⅰ、Ⅲ型胶原表达水平降低(P<0.05);成纤维细胞凋亡。结论rhEndostatin可抑制HS形成,该作用可能与rhEndostatin抑制血管生成,进而促进增生性瘢痕成纤维细胞(HSFs)凋亡,减少胶原的产生与沉积有关。

MTT法检测重组人内抑素对人内皮细胞增殖的影响

目的 探讨观察重组人内抑素对人血管内皮细胞增殖影响的方法。方法 采用MTT法观察不同浓度重组人胎儿内抑素是否对碱性成纤维细胞生长因子刺激的人血管内皮细胞系ECV增殖产生抑制作用。结果 MTT法分析显示细胞活力与光密度改变之间存在线性关系 ,重组人内抑素可抑制胎儿血管内皮细胞ECV的增殖 ,半数抑制浓度约为 3 5 0mg·L-1。结论 MTT法检测重组人内抑素对人血管内皮细胞增殖的抑制作用准确可靠、操作简便。

重组人内抑素对兔耳增生性瘢痕成纤维细胞增殖的影响

目的观察重组人内抑素(rh Endostatin)对兔耳增生性瘢痕成纤维细胞(HSFs)增殖的影响,探讨rh Endostatin抑制HSFs增殖的相关机制。方法制备兔耳增生性瘢痕(HS)模型,分离、培养并鉴定兔耳HSFs;应用四甲基偶氮唑盐(MTT)法和流式细胞仪分别检测rh Endostatin对HSFs增殖和周期的影响。结果分离培养的兔耳细胞经波形蛋白免疫细胞化学染色检测呈阳性。rh Endostatin对HSFs增殖的抑制效应与浓度和作用时间呈依赖关系,测得IC50值为100 mg/L。与正常对照组细胞相比,HSFs G1期细胞比例减少(P<0.01),S期和G2/M期细胞比例增加(P<0.01);与模型组细胞相比,rh Endostatin组细胞G1期比例增加(P<0.01),S期和G2/M期细胞比例减少(P<0.01)。结论rh Endostatin可抑制兔耳HSFs增殖,该作用可能与其引起HSFs细胞周期G1期阻滞相关。

重组人内抑素抑制佐剂性关节炎大鼠滑膜组织中新生血管生成及机制

目的：观察重组人内抑素（rh-End）对佐剂型关节炎大鼠（adjuvant arthritis，AA）滑膜组织血管内皮细胞生长因子（VEGF）生成的抑制作用及部分机制。方法：采用弗氏完全佐剂（诱导的佐剂性关节炎（AA）大鼠模型，足容积法测量关节肿胀程度并对多发性关节炎程度进行评分；观察滑膜组织中病理改变；免疫组织化学法检测VEGF的表达；应用实时荧光定量PCR技术对VEGF mRNA转录水平进行定量分析。结果：CFA诱导AA大鼠模型，致炎后d10，AA大鼠出现继发性炎症，此时皮下注射重组人内抑素。测量关节肿胀程度并对关节炎程度进行评分，rh-End能抑制AA大鼠的继发性足肿胀，降低关节炎指数。病理检查显示AA大鼠的关节组织内滑膜增厚，滑膜衬层细胞增生，单核细胞浸润，骨质侵蚀和新生血管生成，给予rh-End后上述病理改变明显减轻。免疫组织化学法用以观察AA大鼠VEGF的表达和定位，VEGF主要在滑膜细胞的胞浆或细胞膜上着色，细胞质内有棕黄颗粒为阳性表达。结果显示AA大鼠滑膜组织相较于正常滑膜组织有高水平VEGF的表达，而rh-End的阳性细胞群明显减少。VEGF mRNA的表达分析和定量采用TaqMan real-time quantitive-PCR。将标准阳性质粒倍比稀释，起始模板拷贝数依次为：108、107、106以及105拷贝／μgmRNA，循环结束后，以相对拷贝数为横坐标，纵坐标是Ct值绘制本次实验的标准曲线，二者存在线性相关。正常组大鼠滑VEGF／GAPDH的相对拷贝数为1.7，AA模型组大鼠高达5.66，用rh-End处理后，相对拷贝数减少至2.16。结论：重组人内抑素可显著抑制AA大鼠滑膜组织VEGF的表达及新生血管生成。

重组人内抑素对内皮细胞增殖的影响

目的 探讨原核表达的可溶性重组人内抑素(rhEndo)对ECV 30 4内皮细胞和原代培养兔主动脉内皮细胞增殖的影响。方法 利用酶标仪进行噻唑蓝 (MTT)法检测 ,同时采用倒置相差显微镜、电子显微镜、流式细胞仪、半胱天冬酶 3活性分析观察该内抑素对碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)刺激的血管内皮细胞增殖的影响。结果 该rhEndo明显抑制ECV 30 4细胞的增殖 ,MultiCycleDNACycle软件分析表明细胞增殖阻滞在G1期 ,流式细胞仪检测发现该内抑素可诱导ECV 30 4细胞凋亡 ,且与半胱天冬酶 3活性增强有关 ,但对原代培养的兔主动脉内皮细胞增殖并未产生明显的作用。结论 内抑素可明显抑制ECV 30 4细胞增殖并诱导其发生凋亡 ,但对原代培养的兔主动脉内皮细胞增殖没有明显的影响 ,这将有利于与血管新生有关的疾病如癌症等的治疗。

重组人内抑素抑制佐剂性关节炎大鼠滑膜组织中新生血管生成及机制

目的观察重组人内抑素(recombinant human endostatin,rh-End)对佐剂性关节炎(adjuvant-induced arthritis,AA)大鼠滑膜组织新生血管生成的抑制作用及其部分机制研究。方法采用弗氏完全佐剂(Freund's complete adjuvant,CFA)诱导的AA大鼠模型,观察滑膜组织中新生血管生成的病理学改变;免疫组织化学法检测血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表达。实时荧光定量PCR对VEGF的表达进行定量检测。结果rh-End能抑制AA大鼠的继发性足肿胀,对滑膜组织中过度生成的新生血管有抑制作用。rh-End能显著减少AA大鼠关节滑膜组织中高表达的VEGF。结论重组人内抑素可显著抑制AA大鼠滑膜组织VEGF的表达及新生血管生成。