重组人凝血酶真核表达载体的构建及其在CHO细胞中的稳定表达

目的构建含重组人凝血酶基因的重组真核表达载体,并转染哺乳动物细胞CHO,建立稳定表达重组人凝血酶的细胞株。方法利用限制性内切酶EcoR I和Xba I将凝血酶基因插入真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建含人凝血酶基因的重组质粒pcDNA3.1(+)/thrombin,利用双酶切和测序法鉴定。采用阳离子脂质体介导方法,将构建的表达载体转染到CHO细胞中,通过G418加压筛选出阳性细胞克隆,建立稳定表达人凝血酶的细胞株,并扩大培养。采用RT-PCR和SDS-PAGE法检测其mRNA和蛋白质的表达,并对其生物活性进行鉴定。结果重组质粒pcDNA3.1(+)/thrombin经双酶切和测序鉴定证实插入序列准确无误;经RT-PCR和SDS-PAGE法鉴定,转染的CHO细胞可表达、分泌人凝血酶,得到的重组人凝血酶表观相对分子质量(Mr)为43 000左右,与预测一致,且具有降解并凝固牛纤维蛋白原的活性,其比活为234.1 U/mg。结论成功构建了真核表达载体pcDNA3.1(+)/thrombin,并成功地在CHO细胞中表达了具有生物活性的重组人凝血酶,该体系的建立为进一步规模化生产重组人凝血酶奠定了基础。

重组人凝血酶临床应用指导原则

凝血酶是人体凝血机制中的关键酶,重组人凝血酶是通过基因重组技术工业化生产的重组产品,与人体内源性凝血酶的氨基酸序列完全一致,具备与天然凝血酶相同的功能,是具有更优生物安全特性的凝血酶产品。2023年12月,重组人凝血酶在中国首次获批上市,目前中国临床医师对其用药经验尚不充分;因此专家组参考国内外相关研究和临床实践制定了重组人凝血酶的临床用药指导原则,旨在为临床医师提供准确的用药参考。医生应根据患者的具体情况和临床需要,合理选用重组人凝血酶,并遵循指导原则进行用药,以确保安全有效地应用该药物。

重组人凝血酶在肝脏切除术中止血效果的随机对照Ⅲ期临床试验观察

目的评价重组人凝血酶对经外科常规止血后依然渗血的肝脏创面的止血疗效、安全性和免疫原性。方法采用多中心、分层随机、双盲、安慰剂对照Ⅲ期试验,计划在33家研究中心入组510例受试者,凝血酶组与安慰剂组为2∶1分层随机分配。在大约70%受试者完成观察后进行期中分析,期中分析结果支持有效则研究提前终止。主要疗效终点为可评价出血点的6 min内止血率。术后1个月进行安全性分析,同时评估抗药物抗体(ADA)及中和抗体的阳性率。结果截止期中分析,共348例受试者接受随机且给予研究药物,其中男215例,女133例,年龄19~69(52.9±10.9)岁,凝血酶组232例,安慰剂组116例,两组基线特征均衡可比。6 min内止血率凝血酶组和安慰剂组分别为71.6%(95%CI:65.75%~77.36%)和44.0%(95%CI:34.93%~53.00%),组间比较差异有统计学意义(P<0.001)。研究中无≥3级药物相关不良事件和药物相关死亡报告。受试者在使用重组人凝血酶后,无免疫增强ADA发生,也无免疫诱导ADA发生。结论重组人凝血酶用于肝脏切除术中创面渗血的止血效果显著,安全性良好,且显示出低免疫原性特征。

重组人凝血酶体外药学及体内药效学的研究

目的研究重组人凝血酶的体外药学特性(蛋白质含量及纯度、生物学活性)和体内药效学(促凝血作用)。方法用福林酚法测定重组人凝血酶中蛋白质的含量,以十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法对重组人凝血酶中蛋白质的纯度进行测定,用人凝血酶活性检查法对重组人凝血酶的生物学活性进行测定。将18只雄性新西兰兔用Pristima系统按体质量随机分为空白组(0.9%NaCl溶液)、低剂量实验组(200 U·mL^(-1)重组人凝血酶)、高剂量实验组(1000 U·mL^(-1)重组人凝血酶),每组6只。以兔肝损伤模型考察重组人凝血酶的促凝血作用。结果重组人凝血酶的蛋白质含量为每支(1.980±0.024)mg,生物学活性为每支(5764.3±197.7)U,生物学比活性为(2911.2±99.8)U·mg^(-1),其目的蛋白(非还原电泳35 kD处)条带单一,杂蛋白较少。低、高剂量实验组与空白组相比,可以使兔肝创面的平均凝血时间分别缩短57.0%和71.8%,平均失血量分别减少87.7%和91.9%。结论重组人凝血酶具有较高的蛋白质纯度和生物学比活性,体内促凝血作用显著。