重组人前脑啡肽原基因腺相关病毒载体的构建

目的 构建重组人前脑啡肽原基因(hPPE)腺相关病毒载体(AAV)。方法 构建质粒骨架上含有新霉素抗性基因表达盒的重组腺相关病毒(rAAV)载体质粒pSNAV-hPPE并酶切鉴定,转染金黄地鼠胚胎肾细胞(BHK 21),后用G418筛选培养形成稳定携带rAAV载体的混合细胞株BHK／SH1;再用HSV1-rc／△UI2感染、包装此细胞株并收获病毒载体rAAV-hPPE,并行DNA探针点杂交测定病毒滴度。结果 酶切鉴定pSNAV-hPPE重组成功,病毒滴度为2.5×1012v.g.／ml。结论 获得的rAAV-hPPE滴度高,感染性好,可以用于转基因镇痛的实验研究。

大鼠δ阿片受体基因小发卡RNA及人前脑啡肽原基因双表达慢病毒载体的构建与鉴定

目的构建大鼠δ阿片受体(delta opioid receptor,DOR)基因小发卡RNA(shRNA)及人前脑啡肽原基因(hu-man preproenkephalin gene,hPPE)双表达慢病毒载体并鉴定。方法根据大鼠DOR mRNA序列设计shRNA并合成包含正、反义靶序列的互补DNA链,退火后插入至shRNA表达载体pENTR/U6vector中,构建shRNA表达质粒,并转化至感受态细胞DH5α,抽提质粒后进行测序。合成hPPE基因序列并插入到表达载体pcDNA3.1(+)中,转化至感受态细胞DH5α,挑取多个单克隆进行测序验证。将hPPE插入已构建成功的pENTR/U6-shRNA载体中,再与慢病毒载体pLenti7.3/V5-DEST重组,构建慢病毒载体pLenti-CMV-hPPE-U6-shRNA并转化DH5α感受态细胞,筛选阳性克隆并测序验证,保留测序验证正确的LR重组质粒。用构建的慢病毒表达载体pLenti-CMV-hPPE-U6-shRNA和包装质粒共转染293T细胞,包装病毒,并测定滴度。结果经测序验证重组质粒pENTR/U6-shRNA、pcDNA3.1(+)-hPPE和慢病毒载体pLenti-CMV-hPPE-U6-shRNA均构建成功。大鼠δ阿片受体基因小发卡RNA及人前脑啡肽原基因双表达慢病毒包装成功,病毒滴度为1×107 TU/mL。结论大鼠DOR基因小发卡RNA及人前脑啡肽原基因双表达慢病毒载体构建成功,为研究DOR和hPPE在吗啡耐受中的作用机制及探求更加合理的镇痛方式奠定了基础。

人胰岛素样生长因子1前体基因的重组、表达及纯化

目的构建含有人胰岛素样生长因子1(hIGF-1)前体编码基因的重组载体,在E.coliBL21中表达,并探讨其抗原性和应用价值。方法用PCR法,从现有重组质粒pBakPAK8/hIGF-1中,扩增编码hIGF-1前体的基因片段,经双酶切、纯化、连接后得到pET29a(+)/hIGF-1重组体,再将其转化大肠杆菌BL21-CodonPlus并诱导表达。表达产物经镍柱亲和层析纯化后,用Western blot法检测重组蛋白的抗原活性。结果重组持粒pET29a(+)/hIGF-1经双酶切鉴定和测序分析证实构建成功。在大肠杆菌BL21-CodonPlus中经IPTG诱导表达,有一相对分子质量15000的重组蛋白hIGF-1前体,该蛋白经镍柱亲和层析获得了良好的纯化效果,具有特异的抗原活性。结论成功地克隆并表达相对分子质量为15000的hIGF-1前体编码基因,为进一步制备抗hIGF-1抗体和后续hIGF-1生物学功能研究打下了良好基础。

乙型肝炎病毒前S2/S与重组人GM-CSF融合基因的分子克隆及鉴定

目的 为探讨乙型肝炎病毒前S2 (preS2 )和粒细胞 巨噬细胞集落刺激因子(GM -CSF)对乙型肝炎疫苗的免疫增强作用,构建S2 /S(preS2 +HBsAg)与GM -CSF融合基因真核表达载体。方法 采用PCR技术分别扩增出S2 /S大小约846bp的编码基因片段和带有15个甘氨酸接头序列的GM CSF约45 0bp编码基因片段,经T A克隆后分布克隆至载体PcDNA3 .1中,获得PcDNA3 .1 S2 /S GM CSF融合基因表达载体,利用酶切、PCR和DNA序列测定进行鉴定插入片段的大小和方向。结果 经过鉴定该融合基因全长约13 0 0bp ,证实为S2 /S GM- CSF融合基因。结论 乙型肝炎病毒(HBV)S2 /S和GM- CSF融合基因真核表达载体构建成功,为进一步研究其表达和生物学活性奠定了一定基础。

乙肝病毒前S/S抗原的重组表达质粒对HBV转基因小鼠的免疫治疗效应

目的:观察重组表达质粒pcDNA3.1-S2S和pcDNA3.1-S1S2S对HBVDNA复制和抗原表达的抑制效果.方法:以能表达乙肝表面抗原主蛋白S(HBsAg)的重组真核表达质粒为骨架,构建了分别含有HBV前S1抗原和/或前S2抗原编码基因的pcDNA3.1-S1S2S,pcDNA3.1-S2S,并各以100μg肌肉接种C57BL/6HBVDNA转基因小鼠,2,4wk后各加强免疫1次.然后动态检测小鼠血清HBVDNA水平的变化、抗-HBs和前S2抗体的诱生,以及肝组织内HBsAg、前S2抗原的消长情况.结果:小鼠肝组织内HBsAg,前S2抗原呈逐渐减弱的趋势,8wk后各有1/3的小鼠已不能检出.pcDNA3.1-S1S2S组接种后4,8,12wk抗-HBs阳转率分别为50%、67%、100%,明显高于pcDNA3.1-S2S组(17%、33%、50%)(P<0.05);而前S2抗体阳转率均低于17%.接种后8wk,12wk,pcDNA3.1-S1S2S组和pcDNA3.1-S2S组小鼠血清HBVDNA水平明显下降,均低于自身接种前、接种后4wk以及同期对照组(P<0.05).结论:重组表达质粒pcDNA3.1-S2S和pcDNA3.1-S1S2S接种,能够抑制转基因小鼠体内的HBV复制,而重组质粒中S1基因的共表达使抑制作用得到增强.

HBV-前C区反义基因真核表达重组质粒电穿孔转染2.2.15细胞转化方案的条件优化

目的 :探索最佳HBV 前C区反义基因真核表达重组质粒电穿孔转染 2 .2 .1 5细胞的转化条件。方法 :构建含HBV 前C区反义基因真核表达重组质粒后 ,通过控制质粒DNA浓度、电压、电容、时间、温度等实验条件进行电转染观察转染细胞生长情况。结果 :在电压 2 1 0V、电容 975uF、温度 4℃、DNA终浓度在 0 .1 2 5μg/μl至0 .75μg/μl之间时 ,细胞转染生长情况最佳。结论 :上述优化实验条件 ,可明显提高HBV 前C区反义基因真核表达重组质粒电穿孔 2 .2 .1

反相高效液相色谱法对小鼠血清中基因重组人促肾上腺皮质激素前体及其代谢物的测定

采用反相高效液相色谱(RP-HPLC)法测定分析静脉注射基因重组人促肾上腺皮质激素(ACTH)前体蛋白(ProACTH141)后小鼠血清中ProACTH141及其代谢产物ACTH(1-39)的含量变化。结果表明,ProACTH141的半衰期(T_(1/2))为21.9 min;其代谢物ACTH(1-39)在血清中的达峰时间(T_(max))为20 min。ProACTH141和代谢产生的ACTH(1-39)的药时曲线下面积(AUC)分别为538.2和88.2 (mg·L^(-1))·min^(-1)。该方法操作简便,灵敏度高,结果准确,可用于基因重组人促肾上腺皮质激素前体蛋白的药物代谢动力学分析。

HBV C/D重组体的临床意义和C基因启动子/前C区病毒变异

HBV C/D重组体主要流行于中国西部的藏族地区,虽然有关C/D重组体的地域和民族分布已比较明确,但其临床意义和病毒在C基因启动子/前C区(BCP/PC)的变异特点仍不清楚。青海省传染病专科医院Li等进行了一项研究,共纳入174例藏族和汉族慢性HBV感染者,包括慢性乙型肝炎患者115例,肝硬化患者45例,肝癌患者14例,通过高通量测序对HBV的S和BCP/PC区准种组成和位点变异情况进行了分析。结果显示,174例患者中基因型B、C2、D和C/D重组体的比例分别为1.1%(2/174)、19.5%(34/174)、0.6%(1/174)和78.7%(137/174)。对C2和C/D两组感染者的临床资料和病毒变异频率比较显示,C2和C/D在不同疾病进展阶段患者中的比例无显著差异,两种基因型感染者的肝功能指标也无明显差异。

重组腺相关病毒基因药物临床前评价方法的回顾与展望

重组腺相关病毒(rAAV)基因药物在临床应用过程中长期疗效不确定,甚至存在安全性风险,是制约其广泛应用的主要障碍.对现有rAAV基因药物临床前评价方法进行分析和梳理.结果表明:仅进行药效学评价不能揭示rAAV转导的细胞和分子机制,而基于转导过程分析的物理转导与功能转导评价存在结果不一致,不能反映rAAV转导的细胞异质性和靶细胞的空间分布特征等问题,难以准确预测rAAV基因药物的临床疗效和安全性,需要从单分子、单细胞水平开展rAAV载体胞内命运评价的新方法,以切实保障新型rAAV基因药物的临床有效性和安全性.

尿促性腺激素和重组促性腺激素对小鼠胚胎种植前基因表达的影响

辅助生殖技术和生产转基因动物时，促性腺激素是常规药物。两种用于控制性卵巢刺激（cos）的促性腺激素是：重组促性腺激素、尿促性腺激素。Sibug曾报道重组促性腺激素对种植过程没有任何影响，而尿促性腺激素有如：增加染色体异常及移植前后流产率、不利于胚胎种植和延长妊娠时间的不良反应。同自然周期相比，人类使用尿促性腺激素，会导致子宫内膜基因的整体改变。

重组鲑鱼降钙素前体多肽的制备及其性质研究

硫氧还原蛋白的第 38位 Met突变为 Ala的 Trx- s CT- Gly基因在 E.coli BL2 1 ( DE3)中得到高效表达 .用 Thio Bind亲和树脂纯化表达的融合蛋白 .结果说明 38位的 Met突变为 Ala不影响融合蛋白与树脂的特异性结合 ,融合蛋白的纯度达 90 %以上 .在含有 3mol/L尿素的 70 %甲酸中 ,室温 48h,至少 80 %融合蛋白被溴化氰裂解开 .采用 CM-纤维素吸附 ,用稀盐酸解吸附 ,得到纯度为92 %的降钙素前体多肽 s CT- Gly.氨基酸的序列分析结构表明 ,重组 s CT- Gly的 N端 1 0个氨基酸与预期一致 .在强酸性条件下 ,没有发生氨基酸的脱酰胺反应 ,氨基酸组成分析与预期基本一致 .质谱法测定的分子量为 3492 ,毛细管电泳测定的等电点 p I为 6.46,大鼠降钙素比活性为 1 90 IU/mg左右 ,与天然的人降钙素相当 .

犊牛前胸腺素α基因在大肠埃希菌中的表达及活性分析

以RT-PCR法扩增犊牛前胸腺素α基因(prothymosin-α,ProT-α),与原核表达载体pGEX-4T-1连接生成重组质粒pGEX/ProT-α,再将重组表达质粒转化大肠埃希菌BL21(DE3)。重组菌经IPTG诱导后表达的GST-ProT-α融合蛋白主要存在于细菌裂解液中。SDS-PAGE电泳表明,GST—ProT-α融合蛋白表达量较高,分子量为38 ku;Western-blot和动物细胞试验表明,该产物能与胸腺素α1抗体发生特异性免疫反应,并可显著提高小鼠脾细胞增殖率和NK细胞杀伤活性。

增强型绿色荧光蛋白基因在永生化大鼠神经前体细胞株的表达

目的：研究重组腺相关病毒载体介导的增强型绿色荧光蛋白基因在永生化大鼠神经前体细胞的转染效率及其表达情况．方法：携带增强型绿色荧光蛋白基因的重组腺相关病毒转染永生化大鼠神经前体细胞，持续观察转基因神经前体细胞绿色荧光蛋白的表达情况，并计算转染效率．应用巢蛋白抗体和抗猿肾病毒40大T抗原抗体进行细胞鉴定，50mL／L胎牛血清诱导细胞分化后，应用神经元和星形胶质细胞特异性标志物抗体检测其分化能力。结果：荧光显微镜观察显示转染后24h神经前体细胞即有绿色荧光蛋白表达，转染后72h，大部分细胞表达绿色荧光蛋白，转染效率可达90％，经传代培养8wk后，表达绿色荧光蛋白的阳性细胞仍可高达70％～75％，免疫细胞化学结果显示转绿色荧光蛋白神经前体细胞巢蛋白和抗猿肾病毒40大T抗原抗体染色均为阳性，50mL／L胎牛血清可诱导其分化为神经元和星形胶质细胞．结论：携带增强型绿色荧光蛋白基因的重组腺相关病毒可高效转染永生化大鼠神经前体细胞，并可在细胞中长期稳定地表达，绿色荧光蛋白作为良好的示踪剂可应用于神经前体细胞的体内移植．

不同猪胰岛素前体基因拷贝数Mut^+型毕赤酵母的摇瓶发酵研究

毕赤酵母是优秀的外源蛋白的表达系统之一。本文对Mut^+型的不同PIP基因拷贝数的毕赤酵母进行了摇瓶试验。研究了生长特性以及对外源蛋白表达量的影响等。发现了低拷贝和高拷贝的蛋白表达量、生长情况有差异。G12重组菌的PIP表达量最高为181.6mg/L,是单拷贝重组菌表达量的12.6倍。对于基因拷贝数低于12的菌株,PIP表达水平与PIP基因拷贝数成线性关系(r=0.996)。

胃癌及癌前疾病基因模型研究

此文综述近年来国内外通过直接将调控胃癌的相关基因转染到动物胚胎中,或者基于基因同源重组原理的基因打靶技术,进行基因敲除而建立起来的胃癌及癌前疾病的基因模型,以及不同基因位点的基因模型的表型及病变发生率,发生时间等,它们在胃癌病变机理前瞻性研究及进行抗癌药的药理研究中,必将占据越来越重要的地位。

针对HBV前S2基因三靶位串状核酶的实验研究

我们设计合成了针对HBVaywDNA前S2区第110、122和132位碱基的三靶位串状核酶,观察了核酶对靶基因转录产物的体外切割作用,并将核酶重组到逆转录病毒载体上,转染包装细胞PA317,获取了较高滴度的重组病毒,为进一步研究核酶在细胞内及体内的作用奠定了基础。 核酶基因和靶基因的获取:核酶基因分两个片段进行人工合成,片段间部分互补,通过Klenow酶填补连接成105 bp的全片段。

华支睾吸虫卵黄前体蛋白B基因的识别、序列分析和克隆表达

为识别和克隆华支睾吸虫新基因 ,对华支睾cDNA质粒文库进行随机筛选并测序 ,并利用在线生物信息学工具进行序列分析 ,识别华支睾吸虫未知基因 ,同时根据PGEX -4T- 1多克隆位点及未知基因的序列设计引物 ,PCR扩增目的基因 ,并构建原核重组质粒。结果发现了CsvpB基因 ,其完整阅读框含 76 2个碱基 ,编码 2 5 4个氨基酸 ,理论分子量为 2 7. 7kDa。序列分析表明 ,CsvpB蛋白与其它物种的卵黄前体蛋白有较高的同源性 ,所构建的重组原核表达质粒PGEX- 4T- 1 vpB经PCR、双酶切及测序证实与目标基因相符。

羧端含前S2抗原决定簇的乙肝表面抗原嵌合基因的构建及在毕赤酵母中的表达

目的构建羧端含前S2抗原决定簇的乙肝表面抗原嵌合基因,并在毕赤酵母(Pichia pastoris)中表达。方法用PCR方法,从含乙肝病毒全长基因的质粒中扩增出S和pre-S2(Met1-Gly26)2个基因片段,并将S2融合于S基因的3′端,构建SS2嵌合基因。将上述片段克隆到pBluescriptⅡSK(+)载体中,测序后亚克隆到毕赤酵母表达载体pAO815,构建重组表达质粒。用电转化法将重组质粒导入Pichia GS115细胞,构建重组表达菌株GS115-SS2。重组菌株经甲醇诱导后制备抗原初提液,进行ELISA和Western blot分析。结果表达产物经ELISA检测具有S和前S2抗原性。Western blot分析表明,该融合抗原既能与S抗体结合,也能与前S2抗体结合,其相对分子质量约为27000,与理论值相符。抗原初提物的反向血凝(RPHA)效价达1∶1024,约相当于16μg/ml。结论已成功构建羧端含前S2抗原决定簇的乙肝表面抗原嵌合基因,并在毕赤酵母中得到有效表达。

转基因小鼠作为牛基因重组系的模型

雪印乳业公司制作小鼠的基因重组体(转基因小鼠)在世界上首次获得成功.但是,仅用从尾部抽提的 DNA 和导入基因的杂交确认了基因导入的有无.今后要探讨在基因小鼠体内的表达和表达的脏器特异性.这项成果是在宇都宫大学召开的日本畜产学大会上发表的.

VEGF基因转染内皮前体细胞能促进血管新生

据近期研究报道,内皮前体细胞(EPC)已被用于治疗领域。研究人员在实验中将EPCs经过体外扩增后输注给下肢缺血或心肌缺血的动物模型体内,研究结果发现可成功地促进新血管的生成。但EPC功能有可能受到诸如衰老、糖尿病、高胆固醇血症、高半胱氨酸血症等因素的影响。而基因重组技术的应用则可能成为克服这些潜在问题的手段。