重组人单链白细胞介素12融合基因(rhscIL-12)的构建和真核表达

克隆人 IL - 1 2 ( h IL - 1 2 ) p40和 p35亚单位 c DNA,构建人单链 IL- 1 2 ( rhsc IL- 1 2 )融合基因 ,并在哺乳动物细胞中进行表达。方法 从经 PDBu刺激的 EBV转化的人 B淋巴母细胞株 NC37中提取 m RNA,经 RT- PCR分别获得 h IL- 1 2 p40和 p35亚单位编码序列的 c DNA,运用重组 PCR技术将两段基因通过一疏水性多肽接头 ( Gly4 Ser) 3 DNA序列进行体外基因重组 ,构建 rhsc IL- 1 2融合基因 ,将其插入 pc DNA3.1 ( + )真核表达载体 ,经脂质体转染 COS7细胞进行表达 ,Western blot进行分析。结果 所克隆的 h IL- 1 2 p40、p35c DNA序列和构建的 rhsc IL - 1 2融合基因 DNA序列均经测序得以证实 ,融合基因可在 COS7中表达其产物 rhsc IL- 1 2融合蛋白 ,其分子量为 70 KD,可与鼠抗人 IL - 1 2 p40 /p70单克隆抗体特异性结合。结论 本研究结果为进一步探讨 rhsc IL- 1 2融合蛋白的生物学活性和特性奠定了基础 ,也为 rhsc IL- 1

应用重组PCR技术构建人单链白细胞介素12融合基因

目的构建人单链白细胞介素 12 (hsc IL- 12 )融合基因并在真核细胞中进行表达 ,为进一步研究 hsc IL- 12融合蛋白的生物学活性奠定基础。方法应用重组 PCR技术将 h IL - 12 p40和 p35亚单位两段编码序列的 c DNA通过一疏水性多肽接头 (Gly4Ser) 3碱基序列进行前后拼接 (IL- 12 p40 -多肽接头 - p35 ) ,构建 hsc IL- 12融合基因 ,并进行核苷酸序列测定 ,进一步将 hsc IL - 12融合基因插入 pc DNA3.1真核表达载体中 ,转染 COS- 7细胞表达 hsc IL - 12融合蛋白 ,并行 Western blot分析。结果该融合基因经 DNA序列分析表明 :p40、p35、linker的连接顺序、方向及序列完全正确 ,融合基因可在 COS- 7细胞中表达hsc IL- 12融合蛋白。Western blot显示该融合蛋白分子量为 70 0 0 0 u,可与鼠抗人 IL- 12 p40 /p70单克隆抗体特异性结合。结论重组 PCR技术是十分有效。

小鼠单链白细胞介素-12重组卡介苗的构建与表达

目的:构建携带小鼠白细胞介素-12基因的重组卡介苗(Bacille calmette-guerin,BCG),并鉴定该重组菌向真核细胞递呈质粒的能力。方法:以分子生物学方法构建携带小鼠IL-12基因和分支杆菌复制子OriM的真核穿梭共表达质粒pBM12,以电转化的方式将pBM12质粒转入BCG构建重组BCG,抽提质粒进行PCR鉴定重组菌;将重组菌感染巨噬细胞,通过RT-PCR了解重组菌向真核细胞递呈质粒的能力。结果:电转化方式可将pBM12导入BCG,抽提质粒鉴定出与mIL-12基因相符的目的条带。以该重组BCG感染小鼠巨噬细胞,96h后用RT-PCR法也扩增出1632bp左右的基因条带。结论:成功构建含pBM12的重组BCG。该重组BCG能向小鼠巨噬细胞递呈携带基因。

重组白细胞介素4受体(IL-4R)噬菌体单链抗体库构建及筛选

目的应用噬菌体展示技术构建重组白细胞介素4受体（IL-4R）噬菌体单链抗体（sc Fv）库,并从抗体库中进行筛选。方法利用重组人IL-4R（rh IL-4R）蛋白免疫BALB/c小鼠,提取总RNA,反转录PCR扩增V_H和V_L基因,经重叠延伸PCR扩增出带有限制性酶切位点的sc Fv,用限制性内切酶SfiⅠ和NotⅠ分别双酶切sc Fv和p CANTAB5E载体,利用T4连接酶进行连接,转入感受态细菌E.coli TG1中制备转化子;在培养基中培养得到噬菌体单链抗体库;通过3轮富集和筛选,选择抗原亲和力最强的克隆进行测序分析。结果经过3轮筛选,构建了库容为2×10~8的rh IL-4R单链抗体库,测序结果显示抗rh IL-4R蛋白sc Fv基因全长741 bp,编码247个氨基酸。通过VBASE2数据库分析,抗rh IL-4R蛋白的V_H和V_L基因序列都存在3个互补决定区和4个骨架区。结论成功构建了抗rh IL-4R蛋白噬菌体sc Fv库。

穿孔素在重组白细胞介素-12治疗小鼠病毒性心肌炎过程中的表达

目的观察重组白细胞介素-12(rmIL-12)治疗小鼠病毒性心肌炎过程中自然杀伤细胞(NK细胞)活性、穿孔素表达水平及小鼠心肌病理变化等指标,探讨rmIL-12治疗病毒性心肌炎的机制。方法选取BALB/c雄性小鼠60只,随机分成6组,分别为空白对照组,病毒对照组,干扰素对照组,rmIL-12小、中、大治疗剂量组,每组10只小鼠。除空白对照组外,余每只小鼠均腹腔注射CVB30.2mL/d,连续3d。开始接种病毒日定为第0天,从第0天开始,于接种病毒4h,空白对照组和病毒对照组腹腔注射9g/L盐水0.1mL/d,干扰素对照组腹腔注射干扰素-α400 IU/d;rmIL-12小、中、大治疗组分别注射1、10、100ng/d rmIL-12,连续5d。第5天每组分别取5只鼠,颈椎脱臼处死,取心脏,留取心脏标本用于做心肌病理学检测。应用四甲基偶氮唑蓝法检测各组小鼠脾脏NK细胞活性。Trizol试剂提取心脏组织总RNA,应用RT-PCR法检测小鼠心脏穿孔素表达水平,应用HE染色法观察小鼠心肌病理改变。结果NK细胞活性病毒对照组与rmIL-12中剂量组及大剂量组比较有显著差异(Pa<0.05),与干扰素对照组及小剂量治疗组比较无明显差异(Pa>0.05)。NK细胞活性随着rmIL-12剂量的增加而增加。空白对照组无穿孔素表达,rmIL-12中剂量组和大剂量组表达量多于小剂量组和干扰素对照组。各组心肌炎性变化以rmIL-12中剂量治疗组心肌炎性反应浸润最轻,而rmIL-12大剂量组心肌细胞变性坏死最重。结论适当增加NK细胞的活性可以减轻心肌细胞的损伤,但NK细胞活性过度增加会加重心肌细胞损伤。rmIL-12通过增加NK细胞活性而增加了穿孔素的表达。穿孔素表达量随rmIL-12治疗剂量的增加而增加。

人单链白细胞介素12的原核表达和生物学活性鉴定

目的构建含人单链白细胞介素12(hscIL-12)基因的原核表达载体,在大肠杆菌中表达具有活性的hscIL-12。方法 PCR法从质粒pCA13-hscIL-12中扩增hscIL-12基因,经酶切、连接构建原核表达载体pET28a(+)-hscIL-12,转入到大肠杆菌BL21(DE3)中,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,收集菌液进行蛋白质印迹分析,经镍柱亲和层析(Ni2+-NTA)纯化,体外增殖实验检测其生物学活性。结果 PCR扩增、双酶切及DNA序列测定证实pET28a(+)载体上成功插入了hscIL-12基因片段。表达产物经SDS-PAGE电泳分析,证明其相对分子质量为70×103;蛋白质印记表明重组蛋白具有hscIL-12抗原活性;表达产物纯化、复性后进行体外生物学活性实验表明,该重组蛋白能刺激外周血单核细胞(PBMC)产生IFN-γ。结论 pET28a(+)-hscIL-12原核表达载体的构建和重组hscIL-12蛋白的制备为进一步研究hscIL-12生物学功能和临床应用奠定了基础。

白细胞介素12重组腺病毒质粒转染骨髓间充质干细胞

背景:有研究表明,骨髓间充质干细胞易于外源基因的导入和表达,且具有较弱的免疫抗原性和免疫调节功能,强大的迁移力和趋瘤性,因而逐渐显露其具有作为抗肿瘤基因治疗负载体系的优越性。目的:拟应用白细胞介素12重组腺病毒质粒AdEasy-白细胞介素12转染骨髓间充质干细胞,构建表达外源性白细胞介素12的骨髓间充质干细胞。设计、时间及地点:以细胞为对象的开放性实验,于2008-06在辽宁医学院实验中心及中国医科大学实验中心完成。材料:原代骨髓间充质干细胞由辽宁医学院外科学实验室构建,白细胞介素12重组腺病毒载体AdIL-12由辽宁医学院分子生物学实验室构建。方法:分离培养SD大鼠骨髓间充质干细胞,免疫组织化学及流式细胞技术鉴定细胞表面标志物,应用腺病毒介导白细胞介素12基因转染大鼠骨髓间充质干细胞。主要观察指标:以反转录-聚合酶链反应及Western Blotting技术检测转染后的骨髓间充质干细胞的白细胞介素12基因mRNA及蛋白表达。结果:腺病毒介导白细胞介素12基因转染骨髓间充质干细胞后,通过反转录-聚合酶链反应及Western Blotting技术检测,结果证实白细胞介素12基因在mRNA及蛋白水平均有表达,而未经转染的骨髓间充质干细胞内无白细胞介素12基因及蛋白表达。结论:应用白细胞介素12重组腺病毒质粒成功构建了在mRNA及蛋白水平表达外源性白细胞介素12基因的骨髓间充质干细胞。

抗重组人白细胞介素-12单克隆抗体的制备及初步应用

目的制备抗重组人白细胞介素-12(rhIL-12)单克隆抗体(McAb),并建立检测IL-12的双抗体夹心ELISA方法。方法以纯化的rhIL-12(p70)免疫BALB/c小鼠,制备单克隆抗体,建立双抗体夹心ELISA法,检测胃癌患者术前、术后血清IL-12水平的变化。结果筛选出3株稳定分泌抗rhIL-12的单抗杂交瘤细胞株,纯化后单抗纯度达95%以上。免疫球蛋白亚类2株为IgG1,1株为IgG2a,轻链属!型,相对亲和力依次为EM5>EM6>EV9。Western blot及ELISA交叉试验表明,单抗具有良好的特异性。建立的双抗体夹心ELISA方法检测rhIL-12的最低检出限为20pg/ml,线性范围为25～3200pg/ml。应用此法检测胃癌患者术前血清IL-12水平较正常对照组明显降低,术后10d明显升高。术后给予免疫增强型NE组IL-12水平较未给予组明显升高。结论制备的抗rhIL-12单克隆抗体,能够用于IL-12的体内外免疫学检测,为IL-12的研究、检测及临床应用奠定了基础。

^(125)I示踪法研究重组人白细胞介素-12在大鼠体内各组织中的分布

试验采用125I同位素示踪法结合三氯醋酸(TCA)沉淀法来测定各主要组织器官的总放射性浓度和酸沉部分放射性浓度,从而获得rhIL-12在动物(SD大鼠)体内的吸收、分布数据.结果表明,在SD大鼠皮下注射标记药物0~120 h之间,测定大鼠的器官、组织和体液中均有该药物的存在,但在泌尿系统中的含量最高,在各组织器官中12 h达到高峰,以后逐渐下降.

携带小鼠白细胞介素-12 siRNA基因重组腺病毒载体的构建及其在树突状细胞中的表达

目的:构建载有白细胞介素-12干扰RNA(IL-12si RNA)基因的,能在树突状细胞(DC)表达的重组腺病毒载体,为免疫耐受提供基础。方法:将IL-12p35si RNA和IL-12p40si RNAcDNA克隆于腺病毒穿梭质粒pShuttle2,得到重组质粒,并与腺病毒骨架质粒BD Adeno-XTM体外连接后代共转化大肠杆菌DH5α菌株,重组腺病毒质粒经过293细胞的包装扩增及氯化铯(CsCl)纯化,生成带有IL-12p35和IL-12p40si RNA基因的重组腺病毒载体,感染DC细胞。结果:经形态学、病毒DNA酶切、聚合酶链反应(PCR)和逆转录(RT)等方法的鉴定,证实了载体构建的正确性;经测定,病毒滴度为2.5×1010efu/ml。结论:成功构建带有IL-12p35si RNA和IL-12p40si RNAcDNA的重组腺病毒载体,其所携带的载体能够转染小鼠DC并干扰其在DC中表达,为进一步的研究奠定了基础。

重组腺伴随病毒载体表达人白细胞介素12的研究

白细胞介素 12 (IL - 12 )具有广谱抗肿瘤、抗感染的作用 ,是由两个亚单位 40kD(p40 )和 35kD(p35 )通过二硫键构成的杂合体 ,有可能通过分别表达亚单位的方式来表达有功能活性的IL - 12。该实验尝试利用重组腺伴随病毒 (rAAV)载体进行人IL - 12 (hIL - 12 )双亚基共表达 ,将hIL - 12的两个亚基分别克隆到AAV载体质粒pSNAV中 ,构建成 pSNAV -IL12 - p35和pSNAV -IL12 - p40质粒 ,经转染、G418筛选后建立了rAAV载体细胞株。采用先前建立的rAAV的生产方法 ,获得了rAAV -IL12 -p35和rAAV -IL12 - p40 ,在体外将两种rAAV共同感染BHK - 2 1细胞 ,48h后收集细胞培养上清进行免疫学和生物学活性检测。经ELISA检测 ,产生的hIL - 12 p70的含量为 10 185 pg/ml;在体外促进IFN -γ分泌实验中 ,加入hIL - 12的PBMC分泌的IFN -γ含量为 37 2mg/ml。实验结果说明 :采用两个AAV载体分别表达亚单位的方法可以表达具有功能活性的hIL - 12 ,为IL -

重组人白细胞介素12对健康人外周血单个核细胞产生γ干扰素影响的研究

目的建立重组人白细胞介素12(rhIL-12)的生物活性检测方法,观察rhIL-12诱导健康人外周血单个核细胞(PBMC)产生γ干扰素(IFN-γ)的水平与剂量和时间之间的关系,揭示其变化规律。方法rhIL-12供试品刺激健康人PBMC分泌IFN-γ,经国际标准品校正,建立rhIL-12生物活性测定方法。以1 ng/mL浓度rhIL-12诱导健康人PBMC,分别于24、48、72、96和120 h 5个时间点用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定培养上清的IFN-γ水平。测定0.1、0.5和2.5 ng/mL 3个浓度rhIL-12诱导人PBMC 72 h后培养上清的IFN-γ水平,用Prism 5.0统计软件的重复测量方差分析法对所得数据进行统计学处理。结果rhIL-12供试品的生物活性曲线呈典型S型,IFN-γ含量为最大浓度一半时的供试品浓度(ED50)为(1.008±0.238)ng/mL,供试品rhIL-12效价为7 938 IU/mL。测定1ng/mL浓度rhIL-12刺激健康人PBMC后5个时间点培养上清中IFN-γ显示,不同个体高峰出现时间有所不同,在高峰出现前均呈现递增趋势。高、中、低3个浓度rhIL-12分别诱导健康人PBMC产生的IFN-γ水平与浓度之间呈显著量效关系,且在0.1 ng/mL的极低浓度即可诱生高水平IFN-γ。结论rhIL-12供试品生物活性良好,与国际标准品比对基本一致,不同人群对rhIL-12的应答高峰存在个体差异,以诱生IFN-γ作为评价rhIL-12生物活性的指标具有明显的量效关系。

重组人白细胞介素12的纯化与鉴定

目的探索重组人白细胞介素12(rhIL-12)的纯化与鉴定方法。方法采用Millipore超滤浓缩系统对含rhIL-12的无血清培养上清进行浓缩,用阴离子交换色谱柱,阳离子交换色谱柱和尺寸排阻色谱柱纯化出rhIL-12;并对rhIL-12的纯度、活性及氨基酸序列进行检测。结果纯化后产物经Western blot鉴定(P35、P40)为rhIL-12,毛细管电泳法测得其纯度在98%以上;生物学活性达8.0×106IU/mg,且氨基酸序列与已报道的序列相一致。结论建立了获得高纯度、高生物活性的rhIL-12的纯化与鉴定方法。

抗HBsAg单链抗体与白细胞介素-2融合蛋白的构建与序列测定

目的:构建以人抗乙肝表面抗原（HBsAg）单链抗体（ScFv）为导向作用,白细胞介素-2（IL-2）为治疗作用的融合蛋白原核表达载体pQE 40/ScFv-IL-2。方法:应用PCR技术将抗HBsAg单链抗体与白细胞介素-2在分子水平上进行基因重组,构建中间载体pGEM7Zf（+）/ScFv-IL-2,经酶切鉴定及序列测定正确后,将目的基因片段克隆到pQE 40表达载体中,转化大肠杆菌,经IPTG诱导表达。结果:SDS-PAGE结果显示在相对分子质量约4.3×104Da处,可见蛋白表达带。以鼠抗人IL-2单克隆抗体经免疫印迹验证,该表达蛋白为所设计的融合蛋白。结论:融合蛋白ScFv-IL-2的成功构建及表达,为融合蛋白的纯化和研究开发新型的乙肝导向治疗的基因工程药物打下良好的基础。

宫内感染乙型肝炎病毒儿童白细胞介素12转录研究

目的 探讨外周血单个核细胞白细胞介素 12 (IL-12 )P40转录变化和宫内感染乙型肝炎病毒 (HBV)免疫失败的关系。方法 采用体外细胞培养和半定量RT PCR技术对 2 5例宫内感染免疫失败儿童、8例宫内感染有效儿童及19名正常免疫儿童外周血单个核细胞在丝裂原 (植物血凝素和细菌酯多糖 )、酵母重组乙型肝炎表面抗原 (HBsAg)及无刺激物时IL-12P40mRNA转录水平进行检测。结果 IL 12P40mRNA丝裂原刺激时转录在免疫失败组高于免疫有效儿童 (P =0 .0 42 ) ,自发转录和血清丙氨酸转氨酶水平呈显著正相关 (r =0 .3 89,P =0 .0 0 4)。在小剂量HBsAg刺激时 ,对照组、有效组和免疫失败组转录差异不明显。和小剂量HBsAg刺激时比较 ,大剂量HBsAg刺激时对照组表现为转录显著增加 (P =0 .0 3 9) ,有效组和免疫失败组变化不明显。结论 宫内感染HBV儿童对特异性抗原刺激IL-12反应低下可能是导致免疫失败的机制之一 。

大鼠白细胞介素-6重组腺病毒构建及初步鉴定

目的构建携带大鼠白细胞介素-6(interleukin 6,IL-6)基因的重组腺病毒,为研究IL-6在神经损伤中的生物学作用提供技术手段。方法体外扩增大鼠IL-6基因,定向克隆到pAdTrace-TOX腺病毒穿梭质粒中,构建重组pAdTrace-IL-6过表达腺病毒质粒,并与骨架质粒pAd-Easy-1在BJ5183菌中发生同源重组,获得pAd-IL-6腺病毒载体,经PacⅠ酶切后转染HEK293细胞进行包装扩增。通过Ad-IL-6腺病毒感染PC12细胞,Real-time PCR和Western blot检测PC12细胞中IL-6及STAT3的表达。结果 PCR电泳及酶切、测序鉴定均证实目的基因IL-6正确克隆至腺病毒载体中,所构建的腺病毒Ad-IL-6可感染PC12细胞,有效增加IL-6的表达水平,促进IL-6信号通路中关键蛋白磷酸化STAT3的表达。结论成功构建携带IL-6的重组腺病毒载体,该载体可显著增高PC12细胞中IL-6基因和蛋白表达水平,并上调IL-6相关信号通路。

重组猪单链IL-12的构建及真核表达

目的克隆猪IL-12(pIL-12)p35和p40亚单位cDNA,构建含有重组猪单链IL-12(pscIL-12)融合基因的真核表达质粒并进行表达。方法分别从正常成年肉猪的外周血单个核细胞(PBMCs)和脾淋巴细胞中提取总RNA,经RT-PCR分别获得pIL-12 p35和p40亚单位编码序列的cDNA,应用重叠延伸PCR技术通过一柔性接头(linker)(Gly4Ser)3串联这两个亚基构建融合基因pscIL-12,将融合基因pscIL-12插入pcDNA3.1(+)真核表达载体,通过阳离子聚合物介导转染CHO-K1细胞进行表达,RT-PCR鉴定pscIL-12融合基因在真核细胞中的表达。结果所克隆的pIL-12 p35亚基和p40亚基的编码基因序列和构建的融合基因pscIL-12序列均经PCR、酶切、测序得以证实;融合基因pscIL-12在CHO-K1细胞中成功转录。结论成功构建了pcDNA3.1(+)-pscIL-12融合基因的真核表达质粒;pcDNA3.1(+)-pscIL-12在CHO-K1细胞中成功转录,为进一步探讨pscIL-12融合蛋白的生物学活性和疫苗佐剂效应奠定了基础。

白介素12重组腺病毒载体的构建及其抗肿瘤作用初步观察

[目的]构建携带小鼠白细胞介素12腺病毒载体(AdCMVmIL-12),并观察其对H22肿瘤的抑瘤效果。[方法]构建重组质粒pdlE1SP1BmIL-12,并用该质粒与质粒pJM17共转染293细胞后包装而成AdCMVmIL-12,并进行酶切法鉴定。同时制备肿瘤动物,通过肿瘤内局部注射AdCMVmIL-12,观察其抗肿瘤作用。[结果]酶切鉴定显示构建正确,其病毒滴度为1.3×109pfu/ml;当病毒滴度为100MOI时,mIL-12浓度达到3417ng/1×106细胞/24h。动物实验表明,注射AdCMVmIL-12的小鼠,肿瘤体积明显小于对照组(P<0.01),生存期显著延长。[结论]构建AdCMVmIL-12成功,肿瘤内局部注射可发挥抗肿瘤作用。

GLS/IL-12重组BCG的构建及其对小鼠结核病疗效的研究

目的构建携带编码人天然颗粒溶素(GLS)和小鼠IL-12基因质粒(pZM03)的重组卡介苗(BCG),并观察其对结核分枝杆菌感染的疗效与机制。方法将分枝杆菌复制子OriM克隆进已含GLS和IL-12的多启动子真核共表达载体pBudCE4.1中(pZM02),得到穿梭质粒pZM03,以pZM03电转化BCG获得重组BCG。结核分枝杆菌H37Rv感染Balb/c小鼠4周后分别用生理盐水、BCG、pZM03和重组BCG治疗,于第一次治疗后3个月,处死小鼠,检测器官荷菌量、脾淋巴细胞IFN-γ和TNF-α的分泌水平、血清IL-12和肺、脾组织中GLS表达,同时观察小鼠肺、脾组织病理改变情况。结果重组BCG治疗组肺、脾组织荷菌量比生理盐水组、BCG组和质粒组显著降低。重组BCG组和pZM03组经PPD刺激后IFN-γ和TNF-α分泌水平明显高于BCG组和生理盐水组。重组BCG组血清IL-12水平明显高于生理盐水组,但与pZM03质粒组和BCG载体组无明显差异。用免疫组化检测到小鼠肺及脾组织中GLS的表达。生理盐水和BCG组肺组织病理改变以渗出为主,病变广泛,增生改变不明显;重组BCG病变范围局限,并有大量类上皮细胞、泡沫细胞等细胞出现。结论成功构建携带GLS和IL-12的重组BCG;重组BCG对小鼠结核病有一定免疫治疗作用,系增强宿主Th1型免疫应答和抗菌活性有关。