重组人可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体纯化中试工艺研究

目的摸索一条适合重组人可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的中试分离纯化工艺。方法发酵后菌体经洗涤、超声破碎和2步盐析等预处理后,经过3步色谱纯化,对最终蛋白质进行纯度、内毒素和活性检测。结果目的蛋白质纯度达98%以上,生物活性为4.8×107-6.94×107U/mg,热原符合标准。最终1L发酵液经过分离纯化,可以得到目的蛋白质200mg以上。结论此工艺纯化收率高,蛋白质纯度高,生物活性好,重复性好,适合工业化生产。

人重组可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)诱导急性髓系白血病细胞凋亡的实验研究

为了研究肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体 (TRAIL)对急性髓系白血病 (AML)细胞的作用 ,通过MTT比色法测定不同浓度TRAIL对 3 9例AML患者 (病例组 )和 2 1例健康人 (对照组 )的骨髓或外周血单个核细胞的杀伤率 ,用流式细胞术检测细胞凋亡。结果发现 ,不同浓度TRAIL对AML细胞均有不同程度的杀伤作用 ,而对正常细胞无此作用。结论 :TRAIL能通过诱导细胞凋亡而杀伤AML细胞 ,是一种有望应用于临床白血病治疗的新型生物制剂。

可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体重组腺病毒载体的构建及其在肝癌细胞株中的表达

背景:肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)能诱导30余种人类肿瘤细胞凋亡,在抗肿瘤治疗中具有广阔应用前景。目的:构建携带可溶性TRAIL基因的复制缺陷型重组腺病毒载体,鉴定其在肝癌细胞株中的表达。方法:以重叠延伸聚合酶链反应(PCR)扩增白细胞介素(IL)-2信号肽和TRAIL膜外区融合片段,克隆于腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV,转化含复制缺陷型腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的大肠杆菌pAdBJ5183,经细菌内同源重组产生重组腺病毒Ad-IL-2-TRAIL,以脂质体法转染HEK293细胞包装病毒,感染肝癌细胞株HepG2,荧光显微镜下观察增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的表达。结果:成功构建了携带可溶性TRAIL基因的复制缺陷型重组腺病毒载体。病毒感染HepG2细胞48h后,超过95%的细胞中出现绿色荧光。结论:所构建的复制缺陷型重组腺病毒Ad-IL-2-TRAIL可在肝癌细胞中高效表达可溶性TRAIL,为进一步行肿瘤TRAIL基因治疗提供了实验依据。

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因多态性与糖尿病型牙周炎易感性的关系探讨

目的:探讨肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumor necrosis factor-associated apoptosis-inducing ligand,TRAIL基因多态性与糖尿病型牙周炎易感性的相关性。方法:选择2022年9月—2023年9月收治的150例2型糖尿病患者作为研究对象,根据患者是否合并牙周炎分为合并组(n=50)、非合并组(n=50)和对照组(n=50)。收集患者临床病历资料,检测TRAIL G1525A与C1595T基因多态性,分析2型糖尿病型牙周炎的影响因素。采用SPSS 19.0软件包对数据进行统计学分析。结果:合并组和非合并组空腹血糖(FBG)、附着丧失(AL)、龈沟出血指数(SBI)和血钙显著低于对照组,糖化血红蛋白(HbA1c)和血清碱性磷酸酶(ALP)显著高于对照组(P<0.05)。合并组TRAIL G1525A基因中GG基因频率显著高于非合并组和对照组(P<0.05)。3组TRAIL C1595T各基因型分布相比,差异无统计学意义(P>0.05)。HbA1c、AL、SBI、ALP和TRAIL G1525A多态性是牙周炎的危险因素(P<0.05)。TRAIL G1525ALeuGG位点在中重度与轻度牙周炎患者中的分布相比,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:TRAIL G1525A基因与糖尿病型牙周炎的易感性相关,GG基因型的2型糖尿病患者患牙周炎风险较高。

强直性脊柱炎患者血清可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的表达及其临床意义

目的:探讨血清可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(sTRAIL)在强直性脊柱炎(AS)患者、类风湿性关节炎(RA)患者及健康对照间的表达差异及其临床意义。方法:60例AS患者按HLA-B27抗原测定结果分为阳性38例,阴性22例;按Bath活动指标分为活动组41例,非活动组19例;另设20例RA患者和30例健康体检者作为对照。应用ELISA法检测上述研究对象血清sTRAIL的浓度,应用ESR自动化分析仪和特定蛋白分析仪测定红细胞沉降率(ESR)和血清C反应蛋白(CRP)含量。结果:HLA-B27阳性和阴性AS患者血清sTRAIL无统计学差异,均明显高于RA组和健康对照组(P<0.01);活动组AS患者血清sTRAIL水平明显高于非活动组(P<0.01);HLA-B27阳性AS患者血清sTRAIL水平与CRP呈明显相关(r=0.609,P=0.000),而阴性患者无显著相关;HLA-B27阳性和阴性AS患者血清sTRAIL与ESR均无明显相关。结论:血清sTRAIL水平在AS中明显上调,且与HLA-B27状态无关,但AS患者血清sTRAIL与CRP的相关性受HLA-B27状态的影响。

阿替普酶联合羟乙基淀粉治疗缺血性脑卒中老年患者的疗效及对血清可溶性肿瘤坏死因子相关性凋亡诱导配体和骨保护素的影响

目的观察阿替普酶联合羟乙基淀粉治疗缺血性脑卒中老年患者的疗效及对血清中可溶性肿瘤坏死因子相关性凋亡诱导配体(sTRAIL)和骨保护素(OPG)水平的影响。方法缺血性脑卒中116例随机分为观察组和对照组各58例,对照组常规治疗基础上加用阿替普酶,观察组在常规治疗基础上加用阿替普酶联合羟乙基淀粉。应用酶联免疫吸附(ELISA)法检测治疗前及治疗2 w后血清中sTRAIL和OPG的表达。结果观察组总有效率明显高于对照组,治疗后两组血清中sTRAIL和OPG的表达均下降,但是观察组的下降值明显高于对照组(P<0.05)。结论阿替普酶联合羟乙基淀粉治疗缺血性脑卒中患者的疗效明显,且能对血清中sTRAIL和OPG的表达有更明显的下调作用,有效地调节内环境。

血浆肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体水平对脓毒症28天死亡的因果关系:一项两样本孟德尔随机化研究

目的应用两样本孟德尔随机化(MR)法分析血浆肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)水平与脓毒症28 d死亡之间的因果关系。方法以已发表的全基因组关联分析为数据来源,从中筛选与脓毒症28 d死亡显著相关的单核苷酸多态性(SNP)作为工具变量。采用逆方差加权(IVW)法、MR-Egger分析法、加权中位数估计法和加权模式法共4种方法进行两样本MR分析,评估血浆TRAIL水平与脓毒症28 d死亡率之间的因果关系。应用“留一”法进行敏感性分析,应用Cochran Q检验进行异质性检测,应用MR-Egger截距检验分析结果的水平多效性。结果最终选取10个强工具变量进行两样本MR分析。IVW法分析结果显示,血浆TRAIL水平与脓毒症28 d死亡率之间存在因果关系[OR=1.186,95%CI(1.005~1.340),P=0.044];其他三种分析方法结果均支持血浆TRAIL水平与脓毒症28 d死亡率之间存在因果关系。敏感性分析提示MR分析结果稳健,异质性分析结果提示SNP之间不存在异质性,多效性分析结果提示工具变量不存在水平多效性(均P>0.05),漏斗图提示结果无偏倚。结论TRAIL与脓毒症28 d死亡率之间存在因果关系,血浆TRAIL水平升高可增加脓毒症28 d死亡的风险。

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体与肿瘤放射治疗

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(Tumor necrosis factor related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)或称凋亡素2配体(Apo2L),是肿瘤坏死因子(TNF)超家族中的新成员,通过与受体结合而选择性地诱导肿瘤细胞、转化细胞及病毒感染的细胞发生程序性死亡。TRAIL在选择性地诱导肿瘤细胞凋亡同时对正常组织细胞无毒副作用。研究发现,联合药物治疗或者放射治疗可以增强TRAIL对肿瘤细胞诱导凋亡的敏感性,因此目前受到国内外学者的普遍关注。本文以TRAIL与放射治疗的联合应用为切入点进行论述,以期理解其在肿瘤放射治疗中的作用。

携带肿瘤坏死因子相关细胞凋亡诱导配体重组腺相关病毒的构建及鉴定

目的:构建一种携带肿瘤坏死因子相关细胞凋亡诱导配体(tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand,TRAIL)基因的重组腺相关病毒(recombined adeo-associated virus,rAAV)载体。方法:实验于2005-09/2006-04在中山大学附属第一医院普通外科实验室完成。首先构建携带可溶性肿瘤坏死因子相关细胞凋亡诱导配体基因的穿梭质粒pAAV-sTRAIL,利用磷酸钙共沉淀法将穿梭质粒共转染入HEK293细胞中,采用细胞内质粒DNA同源重组法构建重组腺相关病毒rAAV-sTRAIL。以噬斑分析法筛选单克隆重组腺相关病毒;聚合酶链反应法鉴定阳性重组腺相关病毒;氯化铯密度梯度离心法纯化病毒;紫外分光光度仪测定病毒颗粒数及纯度,噬斑分析法测定病毒感染滴度;Western blot检测rAAV-sTRAIL在293细胞中的表达情况。结果:成功构建了重组腺相关病毒载体rAAV-sTRAIL,制备的病毒纯度好、滴度高,且在293转导细胞中能有效表达目的基因sTRAIL。结论:构建的重组腺相关病毒载体rAAV-sTRAIL,为组织工程相关细胞转基因构建及临床应用提供先进的载体系统。

重组人促红细胞生成素治疗前后慢性病贫血患者血清肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体水平测定及意义

目的测定重组人促红细胞生成素（EPO）治疗前后慢性病贫血（ACD）患者血清肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体（s TRAIL）水平,明确其与患者hepcidin水平是否相关,探讨血清s TRAIL与ACD发病机制的相关性。方法 37例ACD患者按照病因分为慢性炎症组19例及肿瘤组18例,测定其血清s TRAIL水平、hepcidin水平,后予EPO治疗〔（3～6）万U/w〕,血红蛋白升至120 g/L停止治疗,治疗有效后再次测定患者血清sTRAIL水平、hepcidin水平,与治疗前相比较,并行血清s TRAIL与hepcidin的相关性分析。结果慢性炎症组及肿瘤组治疗前后血清sTRAIL差异显著。ACD患者治疗前后hepcidin比较差异显著。两组治疗前及治疗后血清s TRAIL与hepcidin相关性分析为正相关;两组治疗前血清s TRAIL、hepcidin差异无显著性。结论血清s TRAIL可能与ACD发病机制相关。

重组人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(rhTRAIL)质控方法和质量标准的研究

目的:建立重组人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(rhTRAIL)的质控方法和质量标准。方法:以NCI—H460细胞毒实验测定rhTRAIL的生物学活性,还原型SDS—PAGE确定相对分子质量,SDS—PAGE和反相高效液相色谱测定纯度,毛细管电泳法测定等电点,用胰蛋白酶酶切后分析肽图,其余检测项目按《中国生物制品规程》2000版规定进行。结果:用建立的方法对rhTRAIL原液和成品各1批进行了检定,各项指标均符合《人用重组DNA制品质量控制技术指导原则》和《中国生物制品规程》的要求。结论:建立的质控方法和质量标准具有保证产品安全、有效、质量可控的特点,可用于重组人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(rhTRAIL)产品的常规检定。

老年乙型肝炎患者血清可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体、可溶性血管细胞黏附分子-1、白细胞介素-18和-23的表达

目的分析乙型肝炎老年患者血清可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(sTRAIL)、可溶性血管细胞黏附分子(sVCAM)-1、白细胞介素(IL)-18和IL-23表达及临床意义。方法确诊为乙型肝炎的老年患者165例为观察组,体检证实为健康的老年人90例为对照组,均抽取静脉血,分离血清后应用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测sTRAIL、sVCAM-1和IL-18、-23表达。结果观察组sTRAIL、sVCAM-1和IL-18、-23表达明显高于对照组,观察组sTRAIL、sVCAM-1和IL-18、-23表达与病变严重程度密切相关。观察组sTRAIL和sVCAM-1、IL-18和-23表达均正相关。结论乙型肝炎老年患者血清sTRAIL、sVCAM-1、IL-18和-23高表达可促进疾病发生及进展,四者对判断病情有一定价值。

马来酸桂哌齐特对脑梗死老年患者可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体、骨保护素的影响

脑梗死后患者血清及内环境中细胞因子常异常表达，近年人们关注较多的是可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（sTRAIL）在脑梗死中的作用，STRAIL是细胞凋亡的死亡受体配体，参与神经细胞变性和坏死的全过程，与脑梗死的面积有关。骨保护素（OPG）是目前研究最多的TRAIL的一个受体，STRAIL和OPG对促进脑梗死及继发的脑水肿有重要作用。马来酸桂哌齐特是一种新的哌嗪类钙拮抗剂，具有扩张血管和促进细胞营养代谢的双重作用。本研究观察老年脑梗死患者应用马来酸桂哌齐特治疗后血清中STRAIL和OPG表达及其临床价值。

血清可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体、半乳凝素3、摄食抑制因子-1与慢性阻塞性肺疾病合并抑郁的相关性分析

目的探讨血清中可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(s TRAIL)、半乳凝素3、摄食抑制因子-1与慢性阻塞性肺疾病(COPD)合并抑郁的相关性。方法选取2019年7月至2021年5月河北北方学院附属第一医院收治的COPD急性加重期住院患者173例,其中单纯COPD组103例,COPD合并抑郁组70例,记录并比较两组临床资料及血清s TRAIL、半乳凝素3、摄食抑制因子-1水平。采用logistic回归模型分析COPD合并抑郁的影响因素,进一步绘制受试者操作特征(ROC)曲线评估预测效能。结果COPD合并抑郁组COPD评估测试评分、治疗依从性差占比、合并慢性病占比、独居占比及血清s TRAIL、半乳凝素3、摄食抑制因子-1水平均高于单纯COPD组,第1秒用力呼气量占用力肺活量百分率(FEV_(1)/FVC)、第1秒用力呼气容积占预计值百分率(FEV_(1)pred)、职工医疗保险占比均低于单纯COPD组,差异有统计学意义(P<0.05)。多因素分析结果显示,FEV_(1)/FVC、FEV_(1)pred、治疗依从性、医疗保险类型及血清s TRAIL、半乳凝素3、摄食抑制因子-1均为COPD合并抑郁的影响因素(P<0.05)。ROC曲线分析结果显示,血清s TRAIL、半乳凝素3、摄食抑制因子-1三者单独及联合均对COPD合并抑郁有一定的预测价值(P<0.05)。结论COPD患者发生抑郁与多种因素有关,血清s TRAIL、半乳凝素3、摄食抑制因子-1联合检测对COPD患者合并抑郁诊断有一定价值。

三氧化二砷与重组人肿瘤坏死因子相关细胞凋亡诱导配体协同诱导胃癌细胞凋亡的机制

目的探讨三氧化二砷(As2O3)和重组人肿瘤坏死因子相关细胞凋亡诱导配体(rhTRAIL)协同诱导胃癌细胞SGC7901凋亡的机制。方法分别以As2O3、rhTRAIL及两者联合处理人胃腺癌细胞株SGC7901,用AnnexinV-FITC/PI双染色流式细胞术检测细胞凋亡,用DiOC6荧光染色流式细胞术检测细胞线粒体跨膜电位(ΔΨm),比色法测定细胞Caspase-8、9活性的变化,观察Caspase-8阻断剂(Z-IETD-fmk)与二硫基还原剂(DTT)对SGC7901细胞凋亡、ΔΨm和Caspase-8、9活性变化的影响。结果As2O3和rhTRAIL均可以导致SGC7901细胞ΔΨm随时间延长逐渐下降,两者联用可增加SGC7901细胞ΔΨm下降。Caspase-8阻断剂Z-IETD-fmk可减少rhTRAIL诱导的SGC7901细胞发生凋亡与ΔΨm下降,但不影响As2O3的上述作用。二硫基还原剂(DTT)可减少As2O3诱导的SGC7901细胞凋亡与ΔΨm下降,但不影响rhTRAIL的上述作用。As2O3可导致SGC7901细胞Caspase-9活性升高,这种作用可被二硫基还原剂部分取消,但不受Caspase-8阻断剂的影响;rhTRAIL可导致SGC7901细胞Caspase-8、9活性升高,这种作用可被Caspase-8阻断剂部分取消,但不受二硫基还原剂的影响。结论As2O3与rhTRAIL通过不同机制激活SGC7901细胞凋亡的线粒体途径,两者联合增强了线粒体途径的激活,从而在诱导胃癌细胞凋亡方面形成协同作用。

重组人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体蛋白的DNA残留量检测

目的:重组人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(rhTrail)是一种治疗肿瘤的蛋白药物。其质量控制中,参照2005年《中华人民共和国药典》第三部规定,单支剂量的外源性DNA含量不应超过10ng。通过纯化,我们得到重组大肠杆菌表达的rhTrail蛋白,对其进行了DNA残留检测。方法:参照固相斑点杂交和地高辛核酸探针法,利用DNA地高辛标记和检测试剂盒,制备了地高辛标记宿主DNA探针,对三个rhTrail样品进行DNA残留检测。结果:杂交膜上,宿主DNA带显色,颜色按DNA上样量高低由深至浅,呈梯度差异,三个rhTrail蛋白样品的上样带颜色均较参比的宿主DNA100pg上样带颜色浅。结论:通过换算,三个样品单支剂量的DNA残留均低于10ng,符合DNA残留要求。

重组pichia pastoris高密度发酵表达肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的研究

目的优化rhsTRAIL(重组人可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体)毕氏酵母工程菌在5升Braun发酵罐中的发酵表达工艺参数。方法研究培养基种类、种细胞密度、甘油含量、pH值、甲醇浓度、甲醇流加速率及诱导时间等参数对酵母菌生长与目的蛋白表达的影响。结果在无机盐培养基中，按10％接种OD600=8-12的种菌后，24h酵母菌增殖至OD600=76；甘油含量为1％时，菌体生长速度快(OD600=160)；培养基pH值=5．0，甲醇终浓度为1％时，诱导96h表达量最高达到120mg／L。结论rhsTRAIL在毕氏酵母中发酵工艺参数为：无机盐培养基，pH值：5．0，接种10％ OD600=8-12的种菌，甘油含量1％，甲醇终浓度1％，诱导96h。

肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TRAIL)可溶性胞外区在大肠杆菌中的高效表达

肿瘤坏死相关凋亡诱导配体 (TNF relatedapoptosis inducingligand,TRAIL) ,也称为凋亡素 2配体(Apoptosisin2Ligand ,Apo2L) ,是肿瘤坏死因子超家族成员 ,能够激发肿瘤细胞选择性地发生凋亡 ,并对正常组织细胞几乎无毒性。TRAIL通过细胞表达受体 ,即死亡受体 4和 5 (DeathReceptor 4 ,DR4andDeathReceptor5 )发挥作用 ,而大多数肿瘤细胞表面表达这 2种受体。为了深入研究TRAIL在肿瘤治疗中的价值 ,我们采用RT PCR方法克隆了TRAIL基因 ,并对其细胞外可溶性区域 (1 1 4 2 81氨基酸残基 )在大肠杆菌中进行了表达。重组的TRAIL可溶性蛋白占细菌总蛋白的 4 5 %以上 。