高密度发酵制备重组人可溶性TRAIL

目的 :利用原核重组表达技术 ,完成人可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体 (TRAIL ,又称凋亡素 2配体 ,Apo- 2 L )的中试。方法 :可溶性 TRAIL编码基因插入改建的 p BV 2 2 0载体 ;在发酵过程中 ,控制溶解氧在 30 %～ 5 0 % ,30℃生长 6 h,4 2℃诱导培养 4 h;菌体上清行金属亲和层析。结果 :发酵液中最终菌体密度 D(6 0 0 )达 8.0 (相当于每升发酵液含 15 g湿菌体 ) ,TRAIL占菌体总蛋白的 4 0 %左右 ,含量超过 0 .6 g/ L。其中 ,所表达的 TRAIL 2 0 %～ 30 %在上清而直接有活性 ,70 %～ 80 %呈包涵体。上清用亲和层析一步使其纯度达 70 %以上 ;包涵体超声破菌后经两次洗涤 ,纯度达到 80 %以上。 结论 :TRAIL

重组人可溶性TRAIL分子诱导细胞凋亡机理探讨

目的探讨重组人可溶性TRAIL蛋白(rhsTRAIL)诱导细胞凋亡的机理。 方法应用DNA染料和流式细胞仪定性分别检测rhsTRAIL诱导的细胞凋亡;流式细胞仪检测靶细胞膜表面TRAIL受体表达格局,荧光定量法检测凋亡细胞中Caspase-3活性。 结果100ng/ml人可溶性TRAIL蛋白分子对外周血淋巴细胞无明显毒性,但可诱导肿瘤细胞凋亡,不同的肿瘤细胞凋亡率有差异,凋亡范围在26％-57％。不同细胞表面TRAIL受体表达量不同,外周血淋巴细胞的死亡受体DR4、DR5受体表达5％,而诱骗受体DcRl表达55％,相反肿瘤细胞上的DR4、DR5表达高(40％-88％),而DcRI表达很低(8％-17％)。rhsTRAIL诱导HL-60细胞发生凋亡,其细胞内Caspase-3活性增高。ActD可增加TRAIL抑制细胞生长活性。 结论重组人可溶性TRAIL蛋白分子可诱导肿瘤细胞凋亡,凋亡活性TRAIL受体类型及Caspase-3活性增高有关。

表达重组人可溶性TRAIL的毕氏酵母发酵工艺

目的优化rhsTRAIL毕氏酵母工程菌在5L发酵罐中的发酵表达工艺参数。方法研究培养基种类、细胞密度、甘油含量、pH值、甲醇浓度、甲醇流加速率及诱导时间等参数对工程菌生长及目的蛋白表达的影响,并用电镜观察其诱导肿瘤细胞凋亡特征。结果在无机盐培养基中,按10%接种A600=8～12的种菌后,24h酵母菌增殖至A600=76;甘油含量为1%时,菌体生长速度快(A600=160);培养基pH值5.0,甲醇终浓度为1%时,诱导96h表达量最高达到120mg/L,并具有诱导肿瘤细胞凋亡特征。结论rhsTRAIL毕氏酵母的发酵工艺参数为无机盐培养基,pH值5.0,接种10%A600=8～12的种菌,甘油含量1%,甲醇终浓度1%,诱导96h。

重组可溶性TRAIL的表达与生物学活性

研究重组可溶性TRAIL的抗肿瘤生物学活性。采用基因分子生物学方法构建重组可溶性TRAIL的表达载体 ,建立大肠杆菌表达菌株 ,采用柱层析等方法获得纯化的重组可溶性TRAIL ;采用流式细胞术、细胞活性测定法和体内药效学实验分析重组可溶性TRAIL杀伤肿瘤细胞的生物学活性。结果表明重组可溶性TRAIL在体外可诱导人白血病细胞和肝癌细胞凋亡 ,凋亡率达5 0 %以上。中枢神经系统的肿瘤细胞对重组可溶性TRAIL不敏感。重组可溶性TRAIL在体内能显著抑制人非小细胞肺癌细胞在小鼠体内生长 ,抑制率达 70 %以上。结论为研究制备的重组可溶性TRAIL能在体内外杀死多种肿瘤细胞 ,具有显著的临床应用前景。

重组牛乳过敏原β-乳球蛋白的可溶性表达及其特性分析

目的实现β-乳球蛋白(β-lactoglobulin,BLG)的可溶性表达,并比较重组BLG和天然BLG在结构和免疫原性两个方面的差异性。方法将pET-30a-BLG重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)进行体外诱导表达,并对表达条件进行优化,采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺电泳方法分析重组蛋白的可溶性。利用荧光光谱和圆二色谱比较重组BLG空间结构变化,同时采用竞争抑制酶联免疫吸附实验评价重组BLG致敏性能力。结果在Tris-HCl溶液体系中重组BLG的可溶性表达可达到50%以上,可溶性表达的最优条件为:在Tris-HCl溶液体系中,诱导温度为37℃,IPTG终浓度1.0 mmol/L,诱导4 h。重组BLG表面疏水性下降,可溶性重组BLG的α-螺旋结构减少,经除盐处理后致敏性下降,包涵体重组BLG无规则卷曲结构减少、致敏性上升。结论本研究成功从上清液中纯化得到可溶性重组BLG,且可溶性表达获得的BLG空间结构更接近天然蛋白。

重组人B型钠尿肽联合参附注射液治疗急性心力衰竭的疗效及对sNEP、miR-181b、Cys-C的影响

目的探讨重组人B型钠尿肽(NPPB)联合参附注射液治疗急性心力衰竭对血清可溶性脑啡肽酶(sNEP)、微小RNA-181b(miR-181b)、胱抑素C(Cys-C)水平的影响。方法选取濮阳市中医医院2018年1月至2020年1月收治的82例急性心力衰竭患者,随机分为对照组和观察组,各41例。对照组采用NPPB治疗,观察组加用参附注射液治疗,两组均治疗14 d。比较两组治疗前后体征变化、心功能、血管内皮功能、sNEP、miR-181b、Cys-C水平、不良心血管事件。结果治疗后,两组心率、呼吸频率均降低,且观察组低于对照组,两组血氧饱和度均升高,且观察组高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。治疗后,两组左心室射血分数(LVEF)水平均升高,且观察组高于对照组,左心室收缩末期容积(LVESV)、左心室舒张末期容积(LVEDV)水平均降低,且观察组低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。治疗后,两组一氧化氮水平均升高,且观察组高于对照组,内皮素-1水平均降低,且观察组低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。治疗后,两组血清sNEP、Cys-C水平均降低,且观察组低于对照组,两组miR-181b均升高,且观察组高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。观察组不良心血管事件发生率低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论NPPB联合参附注射液可有效稳定急性心力衰竭患者生命体征,改善心功能和血管内皮功能,提高miR-181b水平,降低血清sNEP、Cys-C水平,疗效确切,且安全性较高。

重组TRAIL诱导肺腺癌细胞系细胞凋亡的实验研究

目的研究重组可溶性TRAIL作用于人肺癌系A549细胞培养物后,细胞凋亡的形态变化和凋亡率测定。方法MTT比色法测定重组TRAIL对肺腺癌A549细胞的生长抑制率。TRAIL处理前后细胞核、质的形态学变化。经不同浓度重组TRAIL处理后A549细胞的双色荧光变化。定量重组TRAIL与亚毒性浓度的CDDP联合使用,对肺腺癌A549细胞生长抑制率和凋亡率的影响。结果重组TRAIL对A549细胞生长有明显的抑制作用,TRAIL100μg.L-1作用24h后,抑制率达到41.6%。细胞形态学观察显示,A549肺腺癌细胞经50μg.L-1TRAIL处理24h后,可观察到典型的细胞凋亡特点。3.3mg.L-1的CDDP与50μg.L-1重组TRAIL合用,A549细胞凋亡率高达75.2%。结论重组TRAIL具有明显的诱导多种恶性肿瘤细胞凋亡的作用;化疗药物CDDP能加强重组TRAIL的抗肿瘤活性。

内皮抑素-可溶性血管内皮细胞生长抑制因子融合基因重组腺病毒的包装与鉴定

目的:构建内皮抑素-可溶性血管内皮细胞生长抑制因子融合基因重组腺病毒载体并包装成重组腺病毒,为下一步基因治疗打下基础。方法:用PCR方法在hENDO基因的5’端引入IL_3信号肽、3’端引入弹性蛋白连接肽序列(linker),再与sVEGI基因连接,插入到pCAl3腺病毒载体中,用脂质体介导包装出重组腺病毒,PCR法对重组腺病毒进行鉴定。结果:构建完成hENDO-sVEGI融合基因重组腺病毒载体,融合基因包括IL_3信号肽、hENDO全长基因、弹性蛋白连接肽序列和sVEGI基因,总长度约1114bp,经酶切鉴定、序列分析证实克隆序列、插入方向和读码框架均正确,可包装出携带融合基因的重组腺病毒,用TCID_(50)法测定粗制重组腺病毒滴度为2×10^(11) TCID_(50)/L。结论:成功构建了hENDO-sVEGI融合基因,连接肽序列使两蛋白空间构象不受影响,IL_3信号肽保证蛋白可被分泌至胞外,完成携带融合基因的重组腺病毒的包装与鉴定,为进一步开展肿瘤基因治疗研究奠定了基础。

重组可溶性KDR及其抗体对内皮细胞的增殖抑制作用

目的 :分析可溶性KDR(sKDR)及其抗体对内皮细胞增殖的抑制作用。方法 :通过ELISA分析大肠杆菌表达的sKDR纯化产物与VEGF16 5结合的能力 ;sKDR免疫家兔制备KDR2 6 2抗血清 ,Wensternblot分析该抗血清与KDR2 6 2蛋白结合的特异性 ;用3 H TdR掺入法 ,MTT法和细胞计数 3种方法分析重组sKDR及其抗体对内皮细胞的增殖抑制作用。结果 :sKDR蛋白可与VEGF16 5特异性结合 ,肝素可增强其结合能力。KDR2 6 2抗血清具有特异性识别KDR蛋白的能力 ,其滴度为 1∶2 0 0 0。用3 H TdR掺入法和MTT 2种方法分析sKDR蛋白及其抗体对内皮细胞的增殖抑制作用结果一致 ,sKDR蛋白浓度在 10 μg/ml,2μg/ml,0 .4μg/ml时对内皮细胞增殖抑制率平均为 5 6 %,44 %和 32 %;抗KDR2 6 2抗体在稀释度为 5 0 ,2 0 0和 80 0倍时对内皮细胞增殖的抑制率平均为 70 %,5 6 %和 43%。细胞计数法测定结果 ,sKDR及抗KDR2 6 2抗体组与VEGF16 5单独刺激组 ,GST和PBS对照组相比 ,内皮细胞增殖被明显抑制 ,随浓度增加抑制活性明显增强 ,但抗体的抑制活性比sKDR蛋白高。结论 :大肠杆菌表达的sKDR及其抗体对内皮细胞均具有明显的增殖抑制作用。

新生肽链的折叠与重组蛋白可溶性表达

新生肽链的折叠与重组蛋白可溶性表达＠崔立斌＠马清钧￥中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所新生肽链的折叠与重组蛋白可溶性表达崔立斌马清钧（中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所１００８５０）大肠杆菌表达系统是目前最常用的外源蛋白表达系统［１］。大肠...

可溶性重组人肿瘤坏死因子受体融合蛋白对大鼠佐剂性关节炎的治疗作用及其可能的机制

目的 研究可溶性重组人肿瘤坏死因子受体融合蛋白 (rhu TNFR Fc)对大鼠佐剂性关节炎的治疗作用及其初步机制。方法 测非致炎侧继发性足肿胀 ,用ELISA法测血清中IL 1β ,TNF α的水平 ;Griess法测上清NO的含量 ;流式细胞术检测T淋巴细胞亚群 ;L92 9细胞杀伤法、ELISA法检测rhu TNFR Fc对大鼠腹腔巨噬细胞分泌TNF α的影响。结果 rhu TNFR Fc(0 4 4 ,0 88,1 75mg·kg- 1 )皮下给药对佐剂性关节炎 (AA)大鼠的继发性足肿胀有显著的治疗作用 ,并呈现较明显的剂量依赖性 ,改善AA大鼠多发性关节炎病变症状 ;通过中和TNF α对AA大鼠过高的血清IL 1β、细胞上清NO的产生有明显的抑制作用 (P <0 0 1) ;但对CD4 + T淋巴细胞与CD8+ T淋巴细胞的比值无明显的影响。结论 rhu TNFR Fc有明显的抗炎作用 ,其抗炎作用可能与其中和TNF α,并进一步使IL 1分泌及NO的生成减少有关。

重组人可溶性凋亡素-2配体在Pichia系统中的表达

目的 :在甲醇营养型酵母 (Pichia)表达系统中表达重组人可溶性肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体 (TRAIL ,凋亡素 - 2配体 )分子。 方法 :人可溶性 TRAIL编码基因片段插入 p IC 3.5酵母表达载体 ,氯化锂转化酵母 GS115株 ,甲醇诱导表达 5 d,SDS- PAGE和 Western- blotting确认表达 ,L 92 9细胞鉴定活性。结果 :发现在酵母细胞中重组表达的 TRAIL在 SDS-PAGE上占总蛋白的 5 0 %以上 ,用抗人 TRAIL多抗可以确认表达了 TRAIL重组分子 ,杀伤肿瘤细胞的比活性较原核表达后复性的 TRAIL有明显提高 ,并能诱导几株肿瘤细胞 DNA片段化 ,说明 TRAIL可能已正确折叠并形成活性必需的高级结构。结论 :在 Pichia系统中正确表达了人可溶性 TRAIL分子。

重组人肿瘤坏死因子可溶性受体Ⅱ(sTNFRⅡ)的纯化

目的 从大肠杆菌破碎液中纯化可溶性肿瘤坏死因子受体Ⅱ,获得能够中和TNF活性的受体蛋白。方法 菌体破碎液经热沉淀处理后,用金属鳌合层析柱纯化重组蛋白。并对蛋白的理化特性和生物学活性进行分析。结果 纯化的重组蛋白纯度大于95％,并且能中和TNF的生物学活性,抑制其对细胞的杀伤作用。结论该工艺能简便有效地纯化出TNF受体蛋白,为进一步深入研究奠定了基础。

重组人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(rhTRAIL)质控方法和质量标准的研究

目的:建立重组人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(rhTRAIL)的质控方法和质量标准。方法:以NCI—H460细胞毒实验测定rhTRAIL的生物学活性,还原型SDS—PAGE确定相对分子质量,SDS—PAGE和反相高效液相色谱测定纯度,毛细管电泳法测定等电点,用胰蛋白酶酶切后分析肽图,其余检测项目按《中国生物制品规程》2000版规定进行。结果:用建立的方法对rhTRAIL原液和成品各1批进行了检定,各项指标均符合《人用重组DNA制品质量控制技术指导原则》和《中国生物制品规程》的要求。结论:建立的质控方法和质量标准具有保证产品安全、有效、质量可控的特点,可用于重组人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(rhTRAIL)产品的常规检定。

重组可溶性IgE受体对小鼠被动皮肤过敏反应的抑制效应

目的:观察重组可溶性IgE受体对I型超敏反应的抑制作用。方法:用卵清蛋白(OVA)作抗原制备抗血清,在动物小鼠身上复制被动皮肤过敏反应模型,以非相关蛋白αtp0为对照,观测自行制备的重组可溶性IgE受体αtp2对其反应的抑制作用。结果:ELISA试验证实,αtp2可竞争性地与IgE受体结合;被动皮肤过敏反应试验中,10μgαtp2对风团的抑制作用为12%。20μg对风团的抑制作用为19%,后者与生理盐水组比较有明显差异(P<0.05)。结论:我们研制的重组可溶性IgE受体αtp2,可竞争性地与IgE结合,被动皮肤过敏试验中,αtp2对风团的大小有明显的抑制作用,但未能彻底抑制风团的形成。

重组人脑源性神经营养因子在大肠杆菌中的可溶性表达及纯化

按照人脑源性神经营养因子(hBDNF)基因成熟肽编码序列设计合成引物,从人基因组DNA中扩增出360bp的片段,插入到改构载体pTIG-trx上,获得了pTIG-trx-BDNF原核表达重组质粒,限制性酶切分析和DNA序列测定均证实该克隆插入片段为hBDNF基因成熟肽编码序列。将该重组质粒转化大肠杆菌BL21穴DE3雪,经IPTG诱导表达,在大肠杆菌表达系统中获得了高效可溶表达,并对表达产物进行了分离纯化,得到纯度大于83%的样品,Western杂交证实该蛋白具有hBDNF抗原活性。

高盐胁迫渗透对SBD2重组蛋白在大肠杆菌中可溶性表达的影响

在基因工程的操作中,包涵体的形成是人们利用大肠杆菌表达外源蛋白质的一大难点.本研究将环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)环状糊精糖基转移酶(CGTase)的淀粉粒结合域(SBD)基因编码序列的两个拷贝通过一连接肽连接(SBD2)后,克隆到大肠杆菌表达载体pTrcHis B上,得到的pTrcHis B/SBD2质粒转化大肠杆菌Top10,研究了不同培养基、不同诱导温度和时间对SBD2蛋白表达的影响.结果表明,利用相容性溶质山梨醇和甜菜碱等,在高盐胁迫下,实现了SBD2重组蛋白质在大肠杆菌中的可溶性表达,这一结果为在体外研究SBD2蛋白的功能奠定了基础.

重组质粒pDsRed1-C1-TRAIL的构建及鉴定

目的:构建重组质粒pDsRed1-C1-TRAIL并鉴定,为下一步利用纳米载体介导FL基因移植作用于结肠癌细胞的体内实验奠定基础。方法:应用基因合成和克隆技术构建重组质粒pDsRed1-C1-TRAIL,并进行酶切鉴定及序列测定,以检测其核苷酸序列与设计是否完全一致。结果:重组质粒pDsRed1-C1-TRAIL经酶切鉴定分析,琼脂糖凝胶电泳鉴定可见清晰地切出与TRAIL基因大小相符的片段并与DNA marker相符,同时进行序列测定,证实其核苷酸序列与设计完全一致。结论:成功构建重组质粒pDsRed1-C1-TRAIL并得到正确鉴定,为下一步结肠癌的基因治疗打下实验基础。

表达鸡TRAIL基因的重组5型腺病毒构建

本研究采用RT-PCR从鸡脾细胞扩增到TRAIL基因,测序验证后,将扩增的TRAIL基因开放阅读框克隆到pShuttle-CMV上,与pAdeasy-1载体在BJ5183细菌内同源重组,获得含有TRAIL基因的5型腺病毒重组质粒,进而将PacⅠ线性化重组质粒转染AD-293细胞,收获重组腺病毒。并对后者进行RT-PCR扩增,获得TRAIL基因片段,经westernblot鉴定显示构建的重组腺病毒可表达TRAIL蛋白,表明TRAIL基因在构建的重组腺病毒rAd5-TRAIL中得到表达。本研究为下一步的动物试验和研究TRAIL基因的抑瘤作用奠定了基础。