重组人巨细胞病毒(HCMV)嵌合肽在毕赤酵母中的表达

目的:在巴斯德毕赤酵母中表达人巨细胞病毒gp52C末端和pp150C末端串联片段的嵌合肽.方法:用SacⅠ和BglⅡ分别酶切CMVp-pPIC9K重组质粒,电打孔法导入毕赤酵母GS115后,在缺组氨酸的MD板上筛选出转化子,然后根据甲醇利用快速型(Mut+)和甲醇利用缓慢型(Muts)菌株的不同生长特点,筛选出Mut+和Muts型转化子,用PCR法进一步鉴定阳性克隆.分别用甲醇诱导Mut+和Muts型转化子表达目的蛋白4d,取培养产物冻干浓缩,进行SDS-PAGE和Westernblotting,筛选出能特异表达目的蛋白的菌株,分析蛋白的含量及纯度.结果:重组人巨细胞病毒可在甲醇利用快速型毕赤酵母中有效表达,其表达量约占培养上清分泌蛋白的76 5%.结论:重组人巨细胞病毒(HCMV)嵌合肽可在真核细胞毕赤酵母中成功表达.

以重组人巨细胞病毒pp65制备的多克隆抗体建立检测感染性病毒颗粒方法

人巨细胞病毒(HCMV)活动性感染是造成器官移植失败的重要原因。建立灵敏、特异的检测方法可为及早发现感染、及时给予抗病毒治疗提供依据。以离子交换和分子筛方法纯化重组表达的HCMVpp65(rp65hp)抗原,经两步纯化后,rp65hp纯度达到95%。免疫家兔制备的抗血清,ELISA抗体滴度高达1∶2560000;免疫印迹证明能与HCMVpp65抗原特异反应。将HCMV病毒感染细胞,以纯化的多克隆抗体建立了间接免疫荧光法,成功地检测到细胞中的病毒。因此,该方法为临床检测HCMV病毒活动性感染奠定了良好的基础。

人巨细胞病毒重组抗原及单克隆抗体在ELISA中的应用

用重组人巨细胞病毒（rhCMV）gp52蛋白作抗原及相应的单克隆抗体酶标记物建立捕获ELISA,检测人血清中的HCMV特异性IgM抗体。其工作浓度均由方阵滴定法确定。并进行精密度、特异性和干扰实验。用该法检测体检献血员 病毒性肝炎患者及疑似CMV感染的肝炎综合症患者血清共计939份。结果gp52蛋白抗原最佳浓度为1μg/ml,酶标单抗的工作浓度为1:1600,批内平均变异系数CV3.7％,批间CV7.9％。634例献血员IgM抗体阳性17例（2.7％）;288例病毒性肝炎患者,阳性10例（3.5％）;17例肝炎综合症患者,阳性11例（64.7％）。均经免疫印迹法证实。该组合特异性强,灵敏度高,不受类风湿因子的影响,结果可靠,优于全病毒抗原构成的检测试剂。适用于临床诊断和流行病学调查。

巴斯德毕赤酵母高密度发酵表达rHC MVp的研究

目的:提高人巨细胞病毒嵌合肽(rHCMVp)在巴斯德毕赤酵母中的表达量,并进行发酵罐高密度发酵。方法:将生长培养基的菌体离心后等量接入诱导培养基中(包括不同体积分数的甲醇、pH值)培养,通过菌体密度检测和发酵液上清的SDS -PAGE结果分析不同条件、不同诱导时间对人巨细胞病毒嵌合肽表达的影响,并依据优化条件进行高密度发酵。结果:摇瓶培养时,转化子在体积分数1%的甲醇pH 6 0的条件下诱导72h ,A6 0 0 (菌体密度)为4 5 2 ,目的蛋白表达量达到10 2mg/L。2L发酵罐进行了高密度发酵,经体积分数1%甲醇诱导4 8h ,最终A6 0 0 (菌体密度)达到12 4 ,每升发酵液中含目的蛋白5 7 2 1mg。结论:通过条件优化,进行高密度发酵,获得大量的rHCMVp。