重组人巨细胞病毒嵌合肽基因在毕赤酵母中的克隆和表达

为了在毕赤酵母中表达带有组氨酸纯化标记的重组人巨细胞病毒嵌合肽 (rHCMVp) ,根据其基因序列 ,设计引物从pPIC9K rHCMVp上扩增得到目的基因片段 ,并导入毕赤酵母诱导型表达载体pPICZαA中。通过电击将线性化的重组质粒转化到毕赤酵母X33细胞中 ,筛选获得表达量较高的重组菌株 ,研究了该菌株生长的培养条件 ,包括不同诱导时间、甲醇浓度、pH值对人巨细胞病毒嵌合肽表达的影响。 2L发酵罐进行了高密度发酵 ,经 1 %的甲醇、pH6 0的条件下诱导48h ,最终菌体密度OD60. 0 达到 1 80 ,每升发酵液中含目的蛋白 78. 7mg ,产量比摇瓶提高了 4 8倍。rHCMVp可通过高密度发酵大量获得。

重组人巨细胞病毒(HCMV)嵌合肽在毕赤酵母中的表达

目的:在巴斯德毕赤酵母中表达人巨细胞病毒gp52C末端和pp150C末端串联片段的嵌合肽.方法:用SacⅠ和BglⅡ分别酶切CMVp-pPIC9K重组质粒,电打孔法导入毕赤酵母GS115后,在缺组氨酸的MD板上筛选出转化子,然后根据甲醇利用快速型(Mut+)和甲醇利用缓慢型(Muts)菌株的不同生长特点,筛选出Mut+和Muts型转化子,用PCR法进一步鉴定阳性克隆.分别用甲醇诱导Mut+和Muts型转化子表达目的蛋白4d,取培养产物冻干浓缩,进行SDS-PAGE和Westernblotting,筛选出能特异表达目的蛋白的菌株,分析蛋白的含量及纯度.结果:重组人巨细胞病毒可在甲醇利用快速型毕赤酵母中有效表达,其表达量约占培养上清分泌蛋白的76 5%.结论:重组人巨细胞病毒(HCMV)嵌合肽可在真核细胞毕赤酵母中成功表达.

重组巨细胞病毒多肽检测特异性IgG抗体及抗体亲合力指数的评价

目的探讨大肠杆菌重组巨细胞病毒(CMV)多肽是否适合于检测CMV特异性IgG抗体以及IgG抗体亲合力指数(AI)。方法利用分子克隆技术克隆CMV的pp150、pp28、pp52和g B这4种基因,大肠杆菌分别表达这些基因,重组蛋白多肽纯化后,建立检测特异性IgG抗体的ELISA方法,与进口ELISA试剂盒同时检测126例CMV IgG阳性和74例CMV IgG阴性血清。根据重组抗原ELISA检测CMV IgG的结果,选取阳性和阴性符合率均相对较高的重组抗原pp150/2、pp150/3和pp150/4,进一步检测8例明确原发感染的婴幼儿血清、7例确定为潜在感染的儿童血清的CMV IgG AI,并与进口试剂检测结果比较。结果制备了8种CMV重组抗原,包括pp150/1、pp150/2、pp150/3、pp150/4、pp28、pp52/1、pp52/2和g B。与进口试剂盒相比,检测CMV IgG抗体时重组抗原pp150/4的阳性符合率最高(90.9%),其次为多肽pp150/3(89.7%)、pp150/2(88.9%)和pp150/1(80.2%)。与进口ELISA试剂盒比较,重组多肽pp150检测CMV IgG抗体的阳性率差异无统计学意义(P均>0.05)。8例经进口试剂确定为原发感染血清的AI值为15.3%~29.8%;以重组抗原pp150/4检测时,4例AI值<30%,4例AI值>30%(39.0%~60.4%),与进口试剂检测值比较差异有统计学意义(P均<0.05)。7例明确为潜在感染的血清进口试剂AI值为59.6%~92.3%,2例经重组抗原检测AI值分别为22.9%和25.1%,与进口试剂检测结果比较差异有统计学意义(P均<0.05)。同样,利用重组抗原pp150/2和pp150/3检测的IgG AI值与进口试剂盒检测值比较差异有统计学意义(P均<0.05)。结论重组多肽pp150具有良好的抗原性,可用于检测CMV IgG抗体,但不适合于CMV IgG AI检测。

丙型肝炎病毒检测技术的研究进展

丙型肝炎病毒(HCV)的实验室检测技术主要包括抗体、核酸以及抗原检测。随着对感染过程的研究和临床诊断的需求,这些技术也日趋成熟。新的检测技术灵敏度和特异性更高,并且基因型的影响逐渐被克服。新兴的核酸配体技术将使传统的HCV检测方法发生巨大的改变。

巴斯德毕赤酵母高密度发酵表达rHC MVp的研究

目的:提高人巨细胞病毒嵌合肽(rHCMVp)在巴斯德毕赤酵母中的表达量,并进行发酵罐高密度发酵。方法:将生长培养基的菌体离心后等量接入诱导培养基中(包括不同体积分数的甲醇、pH值)培养,通过菌体密度检测和发酵液上清的SDS -PAGE结果分析不同条件、不同诱导时间对人巨细胞病毒嵌合肽表达的影响,并依据优化条件进行高密度发酵。结果:摇瓶培养时,转化子在体积分数1%的甲醇pH 6 0的条件下诱导72h ,A6 0 0 (菌体密度)为4 5 2 ,目的蛋白表达量达到10 2mg/L。2L发酵罐进行了高密度发酵,经体积分数1%甲醇诱导4 8h ,最终A6 0 0 (菌体密度)达到12 4 ,每升发酵液中含目的蛋白5 7 2 1mg。结论:通过条件优化,进行高密度发酵,获得大量的rHCMVp。