以重组人巨细胞病毒pp65制备的多克隆抗体建立检测感染性病毒颗粒方法

人巨细胞病毒(HCMV)活动性感染是造成器官移植失败的重要原因。建立灵敏、特异的检测方法可为及早发现感染、及时给予抗病毒治疗提供依据。以离子交换和分子筛方法纯化重组表达的HCMVpp65(rp65hp)抗原,经两步纯化后,rp65hp纯度达到95%。免疫家兔制备的抗血清,ELISA抗体滴度高达1∶2560000;免疫印迹证明能与HCMVpp65抗原特异反应。将HCMV病毒感染细胞,以纯化的多克隆抗体建立了间接免疫荧光法,成功地检测到细胞中的病毒。因此,该方法为临床检测HCMV病毒活动性感染奠定了良好的基础。

重组人巨细胞病毒pp65蛋白与金叶败毒颗粒联合抗人巨细胞病毒效应

目的比较重组人巨细胞病毒(HCMV)pp65蛋白与中药金叶败毒颗粒的抗HCMV作用并探讨二者间的关系。方法用重组HCMVpp65蛋白刺激培养的人外周血单个核细胞,制备HCMV抗原特异性细胞毒T细胞,即pp65-CTL。分别将pp65-CTL、金叶败毒颗粒、pp65-CTL+金叶败毒颗粒、更昔洛韦作用于HCMV感染的人胚肺成纤维细胞(HEL),比较各组对HEL细胞病变的抑制作用,同时用RT-PCR法半定量检测作用前和作用不同时间点HCMVmRNA表达水平的变化。结果pp65-CTL组在HEL细胞感染后72h才开始出现少许细胞病变,有显著抗HCMV作用;pp65-CTL+金叶败毒颗粒组作用不同时间点对HCMVmRNA表达及HCMV所致细胞病变的抑制作用明显强于单一用药。结论重组HCMVpp65蛋白刺激培养的pp65-CTL对HCMV有明显的抑制作用,与中药金叶败毒颗粒有显著的协同作用,可共同应用于HCMV活动性感染的治疗。

巨细胞病毒抗原血症检测在肾移植术后的应用

目的评估巨细胞病毒抗原血症检测方法对诊断肾移植患者巨细胞病毒感染的意义。方法收集2021年9月至2021年12月昆明市第一人民医院就诊90例肾移植患者的110例血样,对其进行巨细胞病毒(cytomegalovirus,CMV)pp65抗原血症检测与Ig G抗体、CMV DNA结果比较,评估CMV pp65抗原血症结果与肌酐、他克莫司(tacrolimus,Tac/FK506)药物浓度、淋巴细胞亚群的相关性。结果CMV pp65抗原血症结果与CMV DNA结果一致性为65.5%,差异具有统计学意义(P<0.05)。CMV pp65抗原血症检测结果与CMV IgG抗体检测结果一致性为57.3%,差异不具有统计学意义(P>0.05)。CMV pp65抗原血症结果与肌酐、FK506药物浓度比较,差异无统计学意义(P>0.05)。CMV pp65抗原血症结果与淋巴细胞亚群比较中,仅与NK细胞绝对值差异有统计学意义(P<0.05)。结论CMV pp65抗原与CMV IgG抗体结果一致性为57.3%。CMV pp65抗原与CMV DNA结果一致性为65.5%,两种方法联合检测,对提高CMV感染临床诊断准确率具有一定意义。在CMV pp65抗原阴性组与阳性组中,血清肌酐水平、全血FK506药物浓度两组间差异无统计学意义,NK细胞绝对值差异具有统计学意义,NK细胞绝对值偏高的肾移植患者,发生CMV感染的概率偏低。

异基因造血干细胞移植后人类巨细胞病毒pp65的监测及疗效、危险因素分析

本研究探讨异基因造血干细胞移植(alloHSCT)后受者外周血白细胞巨细胞病毒(CMV)pp65抗原阳性细胞数的变化及临床意义。以104例HSCT受者为研究对象,采集移植前后及恢复期受者的抗凝血标本,用CMVpp65单克隆抗体荧光免疫组织化学法检测CMV早期抗原,并进行动态观察。结果表明104例HSCT受者中29例移植后检出CMVpp65抗原阳性,检出率27.88%,其中16例为CMV血症,13例为CMV病。29例经抗病毒治疗后25例抗原转为阴性,有效率86.21%,死亡4例,病死率13.79%。CMV感染患者中,受非血缘或单倍体相合异基因HSCT的患者与受同胞全相合异基因HSCT的患者CMV感染率分别为39.29%和14.58%,两者相比较有显著性差异(P<0.05)。0-Ⅰ度急性GVHD组CMV感染的发生率为19.44%,而Ⅱ-IV度急性GVHD组为46.88%,两者间的差异有显著意义(P<0·05)。CMV抗原阳性与阴性患者的急性GVHD发生率有显著性差异(P<0·05)。结论外周血白细胞CMVpp65病毒抗原检测可作为造血干细胞移植后CMV病的监测指标,用于指导移植后抗病毒的治疗和疗效评价。

人巨细胞病毒pp65抗原血症检测方法的建立和初步临床应用

目的 建立人巨细胞病毒抗原 pp6 5 (HCMVpp6 5 )血症特异、灵敏和低成本的酶免组化和荧光免疫组化方法 ,以利于临床推广应用。方法 以HCMV AD16 9感染的人胚肺成纤维细胞 (HELF)爬片作阳性对照 ,选择试剂和材料组建试剂盒 ,并与商品化的同类试剂盒作比较 ,建立人外周血多形核白细胞 (PMNLs)中HCMVpp6 5抗原阳性细胞的检测方法 ,然后再用荧光定量PCR(FQ PCR)方法做相应考评。 结果 我们建立的HCMVpp6 5抗原血症检测法能成功地检出PMNLs中的 pp6 5阳性细胞。其可检测限分别为 10 2 pfu/ml的AD16 9攻击 2 4h后的HELF细胞爬片和 3～ 5个 pp6 5阳性细胞 / 2× 10 5PMNLs ;用高相对分子质量 (5 0 0 0 0 0 )的葡聚糖能快速、有效地分离PMNLs ;用 4 %中性多聚甲醛固定的细胞片 ,于 - 2 0°C或以下可长期保存 (≥ 6个月 ) ,而且 pp6 5抗原性稳定。 结论 自建的试剂盒与同类进口试剂盒相比 ,检测 pp6 5的结果差异无显著性 ,并与FQ PCR的检测结果相一致 ,其检测特异、灵敏、操作简单、费用低廉 ,适宜临床实验室推广应用。

应用间接免疫荧光技术检测人巨细胞病毒-PP65抗原的临床意义

目的:探讨人巨细胞病毒(HCMV)-PP65抗原检测的临床意义。方法:利用间接免疫荧光技术对本院56例住院患者外周血HCMV-PP65抗原进行检测,其中器官移植组35例(肾移植患者13例,肝移植患者14例,骨髓移植患者8例),其他疾病组21例。设本院健康体检者20例为正常对照组。结果:56例标本中有25例检出HCMV-PP65抗原阳性,阳性率为45%。25例抗原阳性患者中,有临床症状的患者外周血中的HCMV-PP65抗原阳性细胞数明显高于无临床症状的HCMV-PP65抗原阳性的患者,两者比较差异有显著性(P<0.01)。正常对照组无一例阳性。结论:HCMV-PP65抗原检测具有简便、敏感的特点,其结果与患者的临床症状相关,可以作为监测HCMV活动性感染的指标,为临床提供诊治依据。

人巨细胞病毒PP65抗原ELISA检测方法的建立

目的用制备好的兔和大鼠PP65多克隆抗体建立检测人巨细胞病毒PP65抗原的ELISA方法。方法优化ELISA检测条件,建立检测PP65抗原的标准曲线,确定检测方法的精密度及检出下限。通过对101份临床疑似HCMV感染标本的检测,并与HCMV-IgM(ELISA)以及HCMV-DNA(FQ-PCR)检测结果的比较,分析了该方法的敏感性和特异性。分别检测HSV-1、HSV-2以及EB病毒感染血标本各5份,分析该方法是否非特异结合疱疹病毒科其他病毒抗原。结果以1∶2 000大鼠pAb包被酶标板,以1∶20 000兔pAb为检测一抗,建立了检测PP65抗原血症的ELISA方法。批间精密度与批内精密度均小于10%,检出下限为5 ng/ml。本方法检测的敏感性和特异性与HCMV-DNA(FQ-PCR)无差别(P>0.05),但敏感性高于HCMV-IgM(ELISA)方法(P<0.05)。对HSV-1、HSV-2以及EB病毒感染标本的检测结果均为阴性,排除了该方法非特异结合疱疹病毒科其他病毒抗原的可能。结论建立了检测PP65抗原血症的间接双抗夹心ELISA方法,该方法具有较好的敏感性、特异性、稳定性和重复性。

荧光定量PCR与PP65抗原检测在诊断儿童巨细胞病毒活动性感染的比较

目的用实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)和pp65抗原检测儿童人巨细胞病毒(HCMV)感染,并对其诊断HCMV活动性感染进行比较评估。方法分析924例HCMV血清学检测阳性的儿童的全血HCMV-DNA荧光定量PCR及HCMV-pp65抗原检测结果,与临床诊断的符合程度进行比较。结果全血HCMV-DNA荧光定量PCR和pp65抗原检测的一致率为81.17%,其标准误为0.39,Kappa值为0.60;PCR检测HCMV感染的灵敏度为98.4%,特异度为97.3%,Youden指数为0.957,PVP和PVN分别为0.961和0.989;pp65抗原检测用于检测HC-MV感染的灵敏度为59.2%,特异度为100%,Youden指数为0.592,PVP和PVN分别为1.00和0.782。结论全血HCMV-DNA荧光定量PCR和pp65抗原检测的结果有较好的一致性,诊断HCMV感染PCR检测的灵敏度较pp65抗原检测的灵敏度要高,而后者的特异度较前者高。二种方法都可用于CMV活动性感染的诊断。

人巨细胞病毒截短被膜磷蛋白pp65的原核表达及抗原性分析

目的利用大肠杆菌表达系统表达截短人巨细胞病毒(HCMV)pp65蛋白,并对其抗原性进行初步鉴定。方法采用PCR扩增HCMV pp65基因961～1 686 bp(321aa-562aa)片段,并将其插入表达载体pET30a(+),转化BL21(DE3)菌株,十二烷基硫酸钠—聚丙稀酰胺凝胶(SDS-PAGE)分析蛋白表达,常规镍柱法纯化目的蛋白,以ELISA法初步检测其抗原性。结果获得相对分子质量约为30 kD的融合蛋白,pp65抗原和全病毒抗原的P/N值分别为2.737、2.535。结论本研究成功表达截短HCMV pp65抗原,并证实其蛋白抗原性优于全病毒抗原;此为HCMV检测试剂盒的研制和疫苗的研究提供了依据。

人巨细胞病毒pp65 IgG-AI快速诊断试剂的临床应用

目的评价人巨细胞病毒(Human cytomegalovirus,HCMV)pp65 IgG-亲和力指数(Avidity index,AI)快速诊断试剂的临床应用价值。方法以自制的截短pp65重组蛋白作为诊断试剂,对本室血清库中保存的标本,采用ELISA间接法检测其特异性IgG抗体,分析该试剂的灵敏度、特异性和准确度。检测临床收集的89份患者血清标本(其中5例被明确诊断为HCMV活动性感染)的pp65 IgG抗体,并与意大利DIESSE公司IgG检测试剂盒结果进行比较。同时,对pp65 IgG阳性标本,运用尿素变性ELISA间接法检测其AI值,与意大利DIESSE公司IgM检测试剂盒结果进行比较,评价AI检测在HCMV感染诊断中的价值。结果用pp65快速诊断试剂检测阳性、阴性血清特异性IgG抗体,均与原确认结果相同,灵敏度、准确度和特异性均达100%。两种诊断试剂IgG抗体检测结果,差异无显著意义。pp65诊断试剂对pp65 IgG阳性标本的AI值进行检测,AI<60%标本共41份,阳性率为46.07%,较参比试剂IgM检测阳性率(23.59%)高;5份明确诊断HCMV活动性感染的患者血清标本中,pp65诊断试剂与参比试剂检测IgG抗体,各有4份阳性,一致率为100%,pp65诊断试剂检测AI值为阳性的标本有3份,其中,参比试剂检测IgM为阳性的仅有1份。临床明确诊断为HCMV肺炎的患者血清标本,诊断试剂检测AI值为可疑阳性,但参比试剂检测HCMV IgM抗体为阴性。结论pp65 IgG-AI快速诊断试剂可初步诊断HCMV感染,简单快速,重复性好,具有良好的临床应用前景。

人巨细胞病毒被膜磷蛋白pp65的检测及其在肾移植受者CMV病诊断中的临床应用

目的建立一种简便诊断肾移植受者人巨细胞病毒(HCMV)活动性感染的方法。方法运用催化信号扩增法检测外周血白细胞中的人巨细胞病毒被膜磷蛋白pp65,并与抗HCMV-IgM检测法作比较。结果检测100例肾移植受者中,HCMVpp65抗原阳性47例,IgM抗体检测阳性41例,pp65抗原阳性细胞数为(71±45)个/2×105个WBC,而有症状的CMV病29例,抗原阳性细胞指数为(83±46)个/2×105个WBC。对照组50名健康人,pp65抗原检测全为阴性。pp65的敏感性、特异性、阳性预测值与阴性预测值分别是100%、74.6%、61.7%和100%。结论该法敏感、简便,可作为肾移植术后HCMV病的早期诊断并可指导抗病毒治疗。

人巨细胞病毒pp65基因疫苗的研制

目的探讨人巨细胞病毒(HCMV)基因疫苗的研制及其预防和治疗HCMV原发和再发感染的效果。方法应用聚合酶链式反应(PCR)扩增HCMVpp65基因全长、巨细胞病毒(CMV)启动子的上下游序列,转化至质粒并载体,测序;合成分泌肽基因,构建自制的含CMV启动子、pp65基因和分泌肽基因的pcDNA5.0转染载体,即HCMVpp65基因疫苗。将该载体疫苗通过脂质转染法转至中国仓鼠卵巢(CHO)细胞,Western点杂交检测CHO细胞上清中pp65蛋白。结果克隆pp65基因全长测序结果与HCMVAD169株上的pp65标准序列比较:一致性为99.99%。构建了含有分泌肽、CMV启动子(含有增强子和内含子)和pp65全长pcDNA5.0的转染载体,即HCMV基因疫苗。转染至CHO细胞,其上清培养提取物Western点杂交阳性。结论含有分泌肽、CMV启动子和pp65cDNA的pcDNA5.0真核载体即粗制的HCMV基因疫苗可成功构建。

人巨细胞病毒cDNA文库的构建、鉴定及pp65阳性克隆筛选

为进一步进行人巨细胞病毒 (HCMV)后基因组功能的研究 ,以及为疫苗分子和早期诊断试剂的研制提供有效工具 ,从HCMVAD1 69株感染 96h的HF细胞中提取HCMV的mRNA ,逆转录合成cDNA片段 ,重组入λgt1 1EcoRI酶切位点之间 ,包装蛋白包装 ,构建HCMVAD1 69株基因组cDNA表达文库。结果表明 ,初始HCMVcDNA文库容量为 3 6× 1 0 6,重组率为 96% ;HCMV鼠多克隆抗血清筛选出 1 68个HCMV阳性克隆 ;地高辛标记pp65特异性寡核苷酸探针原位噬斑杂交筛选出 3 4个pp65阳性克隆 ,再经PCR扩增 ,筛选出 2个pp65阳性克隆 ;pp65PCR扩增产物进一步被Southernblotting证实 ;3 端测序比较 ,同源性为 98%。为进一步克隆。

荧光定量PCR和外周血白细胞pp65抗原血症实验对肾移植术后巨细胞病毒感染的检测

目的 探讨肾移植术后 3个月巨细胞病毒 (CMV)的感染状况 ,比较荧光定量PCR和外周血白细胞 pp6 5抗原血症实验两种方法对肾移植术后巨细胞病毒感染的检测情况和使用价值。方法 分别用荧光定量PCR、外周血白细胞 pp6 5抗原血症实验和ELISA法对我院 2 0 0 1年 1月～2 0 0 2年 12月 5 6例肾移植患肾移植术后 3个月的外周血进行巨细胞病毒的检测。结果 5 6例肾移植患者中CMVpp5 6抗原血症阳性 9例 ( 16 1% ) ,PCR阳性 11例 ( 19 6 % ) ,12例 ( 2 1 4 % )诊断为CMV感染 ,其中 7例为症状性感染 ,5例为无症状性感染。荧光定量PCR和外周血白细胞 pp6 5抗原血症实验的一致性为 92 % ,阳性符合率 6 7% ,阴性符合率 92 %。CMVpp6 5抗原、CMVDNAPCR、CMV IgM的敏感性、特异性分别为 72 %、92 % ;10 0 %、92 % ;4 3%、88%。结论 荧光定量PCR和外周血白细胞 pp6 5抗原血症实验的联合应用 ,对监测CMV活动性感染、临床疗效及预后更加客观。

人巨细胞病毒pp65蛋白的原核表达及活性鉴定

以病毒全基因组为模板,通过PCR技术扩增HCMV pp65基因编码序列,其产物连接到pMD18-T质粒,酶切并回收目的片段后克隆到表达载体pTO-T7,然后将重组质粒pTO-T7-pp65转化大肠杆菌ER2566,大量表达后将重组蛋白进行质谱法分析鉴定,再利用Western blot以及间接ELISA进行重组蛋白的活性及抗原性鉴定.结果显示:通过SDS-PAGE鉴定可知,大肠杆菌可能表达出了重组蛋白,质谱分析结果说明了重组蛋白为pp65蛋白,具有极高可信度,其相对分子质量约为63 kD,从Western blot和间接ELISA(enzyme linked immunosorbent assay)的结果可知,pp65蛋白作为抗原具有良好的免疫反应性与免疫原性,为制备相应的抗原诊断单克隆抗体打下了基础,同时也为开发HCMV IgG快速诊断ELISA试剂盒提供了可选原料.

人巨细胞病毒pp65基因片段的原核表达及鉴定

目的构建人巨细胞病毒(HCMV)pp65基因片段(363～505位氨基酸)的原核表达质粒,并鉴定所表达蛋白的反应原性。方法以含有HCMVpp65全长基因的pGEM-T-pp65质粒为模板,PCR扩增pp65基因第1087～1515位核苷酸片段,酶切后插入pET-21a(+)载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)。经IPTG诱导表达,纯化后进行Western blot鉴定。结果酶切分析和测序证明原核表达质粒pET-21a(+)-pp65构建正确。表达的融合蛋白主要以包涵体形式存在,以1.0mmol/L IPTG诱导5h,目的蛋白的表达量最高。纯化后的蛋白具有良好的反应原性。结论已成功构建了HCMV pp65基因片段原核表达质粒,并在大肠杆菌中表达了融合蛋白。

流式细胞术检测PP65抗原血症在巨细胞病毒性肝炎诊断中的意义

目的:探讨流式细胞术(flowcytometry,FCM)检测PP65抗原血症对巨细胞病毒(humancytomegalovirus,CMV)肝炎的诊断价值。方法:采用流式细胞仪对41例CMV肝炎患儿进行血PP65抗原检测,同时用PCR方法测定尿CMV-DNA并用ELISA法检测血清CMV-IgM,比较3种方法的检测结果,对部分患儿进行短期随访,分析PP65的临床应用价值。结果:41例CMV肝炎中36例检出PP65抗原阳性,阳性率达87.8%,CMV-DNA及IgM的阳性率分别为92.6%及36.6%。全身性感染伴高水平抗原血症,单纯肝炎抗原水平相对较低(P<0.01)。PP65在肝炎恢复期转为阴性或低水平,病情恶化时明显增高。结论:PP65抗原血症检测是诊断活动性CMV感染的有效手段,量化结果有助于监测病情。

CMV-PP65抗原检测在预防肾移植术后巨细胞病毒感染的临床价值

目的 探讨巨细胞病毒PP65抗原（CMV-PP65）检测在预防肾移植术后巨细胞病毒（CMV）感染的临床价值.方法 采用间接免疫荧光法和酶联免疫捕获法检测52例肾移植受者术后CMV-PP65抗原和CMV-IgM抗体.结果 52例肾移植受者中CMV-PP65抗原检测阳性25例,CMV-IgM抗体检测阳性17例,随访3~6个月,共15例发生CMV病,CMV-PP65抗原检测均阳性,CMV-PP65抗原检测的敏感度及阴性预测值均高于CMV-IgM抗体检测;25例患者CMV-PP65抗原检测术后首次出现阳性的平均时间为4.2±3.3周,17例患者CMV-IgM抗体检测术后首次出现阳性的平均时间为8.7±5.8周,两者比较有显著差异性（P〈0.05）.结论 CMV-PP65抗原检测可早期排除和预防肾移植术后CMV感染,值得临床推广应用.

人巨细胞病毒gp52蛋白与pp65蛋白融合表达及初步应用

建立以重组表达HCMV蛋白为抗原的检测试剂盒，提高试剂盒的敏感性及特异性。从病毒及质粒中分别扩增gp52（281～433aa，f1）及pp65（361～473aa，f2）2个片段，以不同酶切位点同时插入到pTrcHisB载体上，筛选正确的重组质粒并在大肠杆菌中诱导表达。表达蛋白rp52～65占菌体总蛋白的30％，以包涵体的形式存在，分子量为35000.以金属螯合亲和层析（IMAC）及分子筛方法纯化表达蛋白，纯度达到96％，得率为22．9％。以间接法检测HCMVIgM阳性血清，敏感性达到90．4％（19／21）。融合蛋白具有良好的抗原性，可代替gp52及pp65作为HCMVIgM抗体检测试剂盒的包被抗原。

人巨细胞病毒pp65特异性抗体测定在原发感染诊断中的应用

目的通过测定患者单份血清人巨细胞病毒(HCMV)pp65特异性IgM抗体和IgG亲和指数(AI),建立HCMV原发感染的临床判断标准。方法从临床收集40份患儿血清和尿标本,以本室自制的pp65为抗原,运用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清标本中HCMVpp65特异性IgM抗体;同时通过尿素变性实验,以6M尿素作为温和蛋白变性剂,测定HCMVpp65IgGAI。尿标本常规处理后接种人胚成纤维(HF)细胞进行病毒分离,观察HCMV特异性细胞病变效应(CPE),聚合酶链反应(PCR)试验检测细胞培养物UL83基因,间接免疫荧光试验检测细胞玻片HCMV抗原。并将病毒分离结果同血清学方法进行比较。结果40例标本中,IgM阳性13例,IgG阳性30例,其中,仅IgM阳性4例,病毒分离结果亦为阳性,可诊断为原发感染;30例IgG阳性标本中,2种抗体均为阳性9例(A组),其中,5例AI<50%,病毒分离结果均为阳性,判断为原发感染;1例AI在50%与60%之间,为可疑原发感染,需要进一步鉴定;3例AI>60%,判断为继发感染。IgG阳性21例(B组),其中仅3例(14.29%)AI<50%,但病毒分离结果为阴性,提示患者不久前曾发生HCMV原发感染,特异性IgM抗体已经转阴,病毒进入潜伏状态;余18例患者AI均>60%,判断为继发感染;2种抗体均为阴性的标本有6例,病毒分离结果亦为阴性,说明患者未被感染。统计学分析,A组与B组之间差异有统计学意义(P<0.05)。血清学方法与病毒分离比较,一致率为75.49%,该方法灵敏度为100%,特异度为87.10%,准确度为90.00%。结论以HCMVpp65重组蛋白为抗原检测特异性抗体以及相应IgGAI的ELISA,可快速诊断HCMV原发感染和继发感染;该方法具有高度特异性与敏感性,操作简便,重复性好,具有良好的临床应用前景。