中国明对虾溶菌酶基因克隆、重组表达与性质分析

溶菌酶是机体先天免疫系统中一个重要的效应分子,参与机体多种免疫反应,在溶菌过程中形成一个水解体系,破坏和消除侵入体内的病原,从而实现机体的免疫防御。从中国明对虾中克隆得到了溶菌酶基因(称为FcLyz基因),该基因全长709bp,其完整的阅读框为477bp,编码158个氨基酸,前18个氨基酸(-1^-18)为信号肽,成熟肽由140个氨基酸组成(1-140aa),其分子量为16.2kD。经SMART分析,该基因具有1个溶菌酶1(LYZ1)结构域(19-130aa)。半定量RT-PCR分析结果表明溶菌酶虽在多种组织中有较低水平的组成性表达,但在细菌诱导的血细胞、心脏、肝胰腺和鳃等多种组织中表达上调。将中国明对虾溶菌酶基因的成熟肽亚克隆进原核表达载体pET-30a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3),再进行诱导表达和亲和纯化,得到了纯化的重组溶菌酶,并进行了抑菌活性检测。结果表明,重组对虾溶菌酶对革兰氏阳性菌的抑菌能力较强,最小抑菌浓度达到3.43μmol/L,但对革兰氏阴性菌抑制作用较小。上述结果表明,该溶菌酶作为一种重要的免疫效应分子,参与了对虾的免疫防御反应。

重组溶葡球菌酶的体外抗菌活性研究

目的:评价重组溶葡球菌酶对545株临床分离葡萄球菌的体外抗茵活性。方法:采用平皿二倍稀释法,测定重组溶葡球菌酶对545株葡萄球菌的最低抑菌浓度(MIC);采用试管二倍稀释法和平皿计数法测定此酶对45株葡萄球菌的最低杀菌浓度(MBC);采用不同浓度重组溶葡球菌酶不同时间的杀菌结果绘制杀菌曲线,检测其对4株受试葡萄球菌的动态杀菌趋势;此外,测定不同培养条件对MIC的影响。结果:此酶对257株金葡球菌具有较强的体外抗菌活性,对288株凝固酶阴性葡萄球菌的抗菌活性相对较弱;结合MBC和杀菌曲线结果,可以判断此酶对敏感菌为快速杀菌作用,并呈浓度依赖性;pH,细菌接种量及高浓度血清蛋白对MIC有一定影响,受试浓度的二价金属离子对MIC影响不明显。结论:重组溶葡球菌酶主要对金葡菌体现强大的抗菌活性,对耐甲氧西林金葡菌(MRSA)和甲氧西林敏感金葡菌(MSSA)的抗菌作用没有明显差别,有进一步研究的价值。

重组海参溶菌酶工程菌发酵及表达产物纯化和性质的研究

旨在研究重组海参i型溶菌酶(Stichopus japonicus lysozyme,SjLys)可溶性表达的发酵条件、纯化及生物学性质。采用摇瓶发酵的培养方式,分别从培养基组分和发酵条件两个方面对获得可溶性重组SjLys进行研究。表达产物通过亲和层析纯化以及凝胶过滤层析脱盐,获得了电泳纯为95%的重组SjLys蛋白。进一步对其生物学活性分析,结果表明该酶最适温度为45℃,最适pH值为6.8,对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均有广谱抑菌作用。上述结果将为海参溶菌酶进行产业化奠定应用基础。

人源类溶菌酶蛋白4的多克隆抗体制备及其表达分析

目的:以原核表达的人源类溶菌酶蛋白4(LYZL4)为免疫原制备多克隆抗体,检测LYZL4在睾丸组织中的定位,为阐明其生理功能提供依据。方法:将LYZL4编码基因克隆于原核表达载体pET32a,IPTG诱导重组LYZL4(r LYZL4)表达。分别使用Ni-NTA树脂和甲壳素亲和层析纯化rLYZL4,采用双层琼脂平板扩散法检测杀菌活性。以Ni-NTA树脂纯化产物为免疫原制备兔抗rLYZL4多克隆抗体,通过ELISA测定抗体效价,Western印迹检测抗体特异性后,检测LYZL4蛋白在人体各组织的分布及其在精子和精浆中存在情况,免疫组化确认LYZL4在人睾丸组织中的定位。结果:原核表达系统可有效表达rLYZL4,其对溶壁微球菌及大肠杆菌无杀灭活性。制备的兔抗rLYZL4多克隆抗体具有很高的效价和特异性,在睾丸、附睾及人精子蛋白提取物中可检测到LYZL4存在,在生精小管中,LYZL4定位于圆形精子细胞及长形精子细胞的顶体上。结论:本研究成功以原核表达的rLYZL4制备了该蛋白的多克隆抗体,确认LYZL4在睾丸和附睾有表达,并定位于精子顶体上,提示其可能与顶体结构或功能相关。

重组人表皮生长因子与复合溶菌酶联合治疗烧伤感染创面的效果研究

目的观察重组人表皮生长因子(金因肽)与复合溶菌酶联合治疗烧伤感染创面的临床效果。方法将80例烧伤感染创面患者采用自身对照选择相同深度的两个创面随机分为治疗组与对照组进行研究治疗。治疗组金因肽与复合溶菌酶联合治疗;对照组金因肽与硝酸银软膏治疗。临床观察创面愈合时间、创面细菌培养转阴换药次数、创面炎性反应情况、创面愈合3个月后期随访有无瘢痕增生的情况。结果治疗组比对照组创面愈合时间明显缩短(P<0.05);创面感染控制有效,后期随访瘢痕增生少。结论金因肽与复合溶菌酶联合治疗烧伤感染创面,明显缩短创面愈合时间,有效控制创面感染,疗效显著,安全性高。

重组人表皮生长因子与复合溶菌酶联合治疗儿童烧伤创面的效果研究

目的:观察重组人表皮生长因子与复合溶菌酶联合治疗儿童烧伤创面的临床效果,为临床治疗儿童烧伤提供一种新的治疗方法。方法:将80例儿童烧伤患者采用自身对照选择相同深度的两个创面随机分为治疗组与对照组进行研究治疗。治疗组给予重组人表皮生长因子与复合溶菌酶联合治疗;对照组给予硝酸银软膏治疗。临床观察创面愈合时间、创面炎症反应发生情况、创面细菌培养情况、过敏反应、创面愈合3个月后期随访有无色素沉着或脱失、瘢痕增生的情况。结果:治疗组比对照组创面愈合时间明显缩短,减少创面炎症反应及感染机会,治疗组明显优于对照组(P<0.05);患者未出现过敏反应和其它不良反应,后期随访瘢痕增生少。结论:重组人表皮生长因子与复合溶菌酶联合治疗儿童烧伤创面,明显缩短创面愈合时间,减轻创面炎症反应,疗效可靠。在今后儿童烧伤创面治疗中具有广阔的临床发展前景,适用于基层医院使用。

重组溶葡球菌酶治疗小型猪皮肤烫伤MRSA感染

目的:评价重组溶葡球菌酶对实验性皮肤烫伤耐甲氧西林金葡菌(MRSA)感染的抗感染作用。方法:用中国实验用小型猪建立局部皮肤烫伤后MRSA感染模型,不同处理组创面治疗3 d或7 d后,进行痂下组织活菌计数及组织病理学观察,评价药物抗菌疗效。结果:重组溶葡球菌酶对烫伤皮肤的感染细菌有较好的清除作用,治疗后d 4和d 8高浓度(1 000 U.mL-1)组创面活菌计数[(5.94±0.61)和(4.03±0.75)lg CFU.g-1组织]均明显低于空白对照组[(7.48±0.33)和(6.32±0.60)lg CFU.g-1组织]和阳性药SD-Ag组创面[(7.44±0.19)和(5.29±0.40)lg CFU.g-1组织],P<0.05或P<0.01;治疗后d 8,中浓度(330 U.mL-1)组创面活细菌计数[(5.10±0.29)lg CFU.g-1组织]明显低于空白对照组创面[(6.32±0.60)lg CFU.g-1组织],P<0.05。组织病理学观察也反映了重组溶葡球菌酶的良好疗效。结论:重组溶葡球菌酶对MRSA引起的实验性皮肤烫伤感染有良好的抗感染作用。

用表达人溶菌酶基因的重组质粒防治干乳期奶牛乳腺炎

将人溶菌酶(human lysozyme,hLYZ)cDNA插入由pcDNA3改造而成的pcDNAK表达载体,用获得的重组载体pcDNAKLYZ转染COS-1细胞,经免疫荧光试验证明能进行正确表达。将重组载体注射于哺乳母鼠,取其乳汁进行溶菌酶活性测定,结果显示,分泌在乳汁中的重组hLYZ高达139mg/L。根据乳汁体细胞检测结果,选择健康奶牛和乳腺炎阳性奶牛,分别在干奶时和产犊前2周2次注射重组质粒pcDNAKLYZ,注射途径为乳腺基部穿刺,注射剂量为300μg/乳区,于产犊后1个月采集奶样进行体细胞检测,结果显示,对前一泌乳期发生的奶牛乳腺炎的治愈率为91.5%,对下一泌乳期奶牛乳腺炎的预防有效率至少为96.97%。由此认为,构建的表达hLYZ基因的重组表达质粒,可以替代抗菌素类油乳剂用于干乳期乳腺炎的防治。

抗感染新药重组人溶菌酶的临床前评价

重组人溶菌酶是经生物技术改构后产生的一类对G+和G-菌都有抗菌效应的一类新药。临床前数据表明它对1 040株致病菌具有抗菌活性,最低抑菌浓度(MIC)范围为0．125～>4000μg·mL-1;此外,它还有抑制冠状病毒、抗炎和镇痛作用。现综述其药效学、毒理学和药动学的研究情况。新型重组人溶菌酶在体内外均安全和有效,有望开发成为新型抗感染药物。

重组人溶菌酶研究进展

与其他来源的溶菌酶相比 ,人溶菌酶具有独特的优越性和多种多样的药理作用效果 ,在临床上具有多种重要应用价值。但天然人溶菌酶来源极其困难 ,利用重组DNA技术进行生产是解决这一难题的有效途径。迄今人们已利用化学合成或从人类细胞组织中制备cDNA等途径获取人溶菌酶基因 ,并在大肠杆菌、酵母菌和真菌表达系统中进行了表达 ,最高水平为 40mg L ,低于人乳中溶菌酶含量 ( 5 0～ 2 5 0mg L) ,虽然距离工业化生产仍有一定距离。但重组人溶菌酶发展前景看好。

重组溶菌酶质粒pcDNAKLYZ治疗泌乳期奶牛乳房炎

通过比较注射人溶菌酶重组质粒pcDNAKLYZ的隐性乳房炎奶牛注射前后的奶样中细菌计数结果,对重组溶菌酶基因工程质粒治疗奶牛乳房炎的效果进行分析。对乳房炎患牛的156个乳区治疗前后312份奶样进行细菌培养,其中在注射前的乳样的培养结果中,阴性率为0(0/156),菌落数在50以内的比率为12.82%(20/156),在51～100的比率为16.67%(26/156),大于等于100的比率为70.51%(110/150);在注射人溶菌酶的重组质粒pcDNAKLYZ后的奶牛乳样的培养结果中,阴性率为51.92%(81/156),菌落数在50以内的比率为45.51%(71/156),菌落数在51～100的比率为0%(0/156),大于等于100的比率为2.56%(4/156)。因此,从细菌计数结果来看,重组质粒组的阴性及小于50的比率(97.44%)远高于治疗前(12.82%),重组质粒的抑菌效果显著(P<0.05),该重组质粒对奶牛乳房炎具有较好的治疗效果。

重组人溶菌酶体外抑菌活性研究

以购买商品化的溶菌酶标准品作为对照,通过平板扩散法检测重组人溶菌酶(rhLYZ)在体外对几株致病菌及益生菌的抑菌作用,同时用梯度稀释法检测重组人溶菌酶的MIC和MBC。分别将重组酶和商品酶做梯度稀释后,滴加到涂布有一定量菌液的MH平板,通过平板扩散法测量各组抑菌环直径大小,从而判定其抑菌活性。结果表明,重组人溶菌酶抑菌活性显著高于标准溶菌酶,低质量浓度的重组酶即可对致病菌的生长产生抑制和杀灭作用。rhLYZ对金黄色葡萄球菌、致病性大肠埃希菌较为敏感,抑菌环直径达到15mm～18mm;对多杀性巴氏杆菌抑菌环直径则达到27.5mm。提示rhLYZ对金黄色葡萄球菌、致病性大肠埃希菌及多杀性巴氏杆菌等病原菌均具有较强抑菌活性。

重组溶葡球菌酶的体外抑菌活性研究

采用试纸片法和肉汤稀释法测定重组溶葡球菌酶(rLspn)的抑菌圈大小、最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC),通过与溶葡球菌酶标准品和两种抗生素相比较,评价rLspn的体外抑菌活性。试纸片法试验结果显示,rLspn有专一抑制金黄色葡萄球菌的作用,而对其他菌株无效;rLspn与标准品的抑菌活性差异不显著(P>0.05);对于耐青霉素的金黄色葡萄球菌,rLspn仍然表现出良好的抑菌活性。肉汤稀释法结果表明rLspn的抑菌活性优于对耐药金黄色葡萄球菌最有效的盐酸万古霉素,MIC为0.1μg/mL^0.2μg/mL。

正癸酸修饰磁性纳米Fe_3O_4对溶菌酶的吸附研究

以沉淀法制备了正癸酸修饰磁性纳米Fe3O4,采用XRD、TEM和FT-IR对修饰前后的磁性纳米粒子的形态、结构进行了表征。将修饰后的磁性纳米粒子用于对溶菌酶蛋白进行吸附分离,研究了溶液的pH、温度、时间、溶菌酶初始浓度、离子强度等因素对吸附过程的影响。结果表明:pH=10.7,吸附温度为25℃,吸附时间为2.0 h,溶菌酶初始浓度为0.30 mg·mL-1,最大吸附容量为35.0 mg·g-1。修饰后的磁性纳米粒子用于从鸡蛋清中提取溶菌酶,纯化倍数为30.9,酶活力收得率为73.0%。

人重组溶菌酶对肉鸡生产性能及胴体品质的影响

研究人重组溶菌酶对肉鸡生产性能、胴体品质的影响,探讨其替代抗生素的可能性及其在肉鸡日粮中添加的最佳剂量。试验结果表明,添加0.3%人重组溶菌酶促生长效果最好。

人重组溶菌酶对肉鸡营养消化及肠道组织结构的影响

研究人重组溶菌酶对肉鸡营养消化及肠道组织结构的影响,探讨其替代抗生素的可能性及其在肉鸡日粮中添加的最佳剂量。结果表明,添加0.2%人重组溶菌酶的促生长效果最好。

采用重组溶菌酶-抗菌肽融合蛋白治疗糖尿病手部感染一例报道

糖尿病手部感染可导致坏疽、截肢,甚至死亡,截肢率远高于糖尿病足。本文报道1例牙签伤致2型糖尿病手部感染患者,手掌见长约8 cm不规则创口,手背见长约3、6、3 cm的3个纵行创口,符合截肢指征。在传统治疗的基础上,创面均匀喷洒重组溶菌酶-抗菌肽融合蛋白喷剂,1次/d。治疗后,患者创面愈合,避免了截肢。重组溶菌酶-抗菌肽融合蛋白应用于糖尿病手部感染是一种安全有效的治疗手段,可使部分患者免除截肢。

牦牛胃溶菌酶抗小鼠腹泻的研究

本研究采用PichiaPink^(TM)毕赤酵母表达系统对牦牛胃溶菌酶进行异源表达,以探索提高重组牦牛胃溶菌酶表达量的方法以及重组牦牛胃溶菌酶对大肠杆菌O111所致小鼠腹泻的治疗作用。试验选取10只体重相近的无特定病原体昆明小鼠,用大肠杆菌O111建立小鼠腹泻模型;建模成功后取30只小鼠随机分为6组,每组5只,设对照组、腹泻模型组、牦牛胃溶菌酶组、重组牦牛胃溶菌酶组、抗生素治疗组、溶菌酶产品治疗组,除对照组和腹泻模型组外其余各组灌胃给药,记录小鼠采食量及体重;第4天采血后全部扑杀,取小鼠十二指肠组织制切片做形态学观察;取肠道内容物进行肠道菌群Alpha和Beta多样性分析。结果表明:重组牦牛胃溶菌酶在诱导96 h时表达量最高,分子质量约为15.6 ku,比活性为1428.58 U/mg。攻毒后腹泻模型组、溶菌酶产品治疗组与对照组相比采食量显著降低(P<0.05);腹泻模型组与对照组相比,白细胞数、淋巴细胞数和中性粒细胞数均有极显著升高(P<0.01);十二指肠病理解剖观察发现,牦牛胃溶菌酶组肠道绒毛有所增长且厚度增加;重组牦牛胃溶菌酶组肠绒毛有所恢复。Alpha多样性分析发现,牦牛胃溶菌酶组的Simpson指数与对照组相比显著增加(P<0.05);腹泻模型组的变形菌门和弯曲杆菌门相对丰度显著增加(P<0.05);重组牦牛胃溶菌酶组和牦牛胃溶菌酶组的厚壁菌门和拟杆菌门相对丰度有所增加。本研究表明,牦牛胃溶菌酶对大肠杆菌引起的腹泻有较好的治疗效果。由于牦牛胃溶菌酶具备较强抗胃蛋白酶能力,其原酶及重组酶在饲料添加剂以及在食品加工和医疗卫生等领域具有一定的应用潜力。

鸡输卵管表达的重组人溶菌酶的鉴定

用直接结晶法从重组载体注射鸡蛋清中提取重组人溶菌酶（rhLYZ），并对其理化及生物学特性进行了鉴定。结果显示，rhLYZ能被hLYZ特异抗体识别；纯化的rhLYZ和天然hLYZ的热稳定性无显著差异，二者在pH3．0～11．0范围内均具有活性，pH为7．0时活性最强。采用最小抑菌浓度法测定了含rhLYZ蛋清和纯化rhLYZ对12种常见细菌的溶菌活性，二者对除有鞭毛伤寒杆菌和鳖嗜水气单胞菌以外的参试茵均有不同程度的抑制作用。表明，表达在重组栽体注射鸡蛋清中的rhLYZ具有与天然hLYZ十分相似的分子质量、热稳定性、pH活性范围和溶菌谱。