重组人白介素12质量标准与检测方法研究

目的:建立白介素12的质量标准与检测方法,用于该产品的质量控制。方法:采用诱导 PBMC 生成 IFN-γ的方法测定生物学活性;用胰酶酶解分析肽图;用分子排阻 HPLC、离子交换 HPLC 和 SDS-PAGE 法分析蛋白纯度;免疫印迹及 N 端氨基酸序列测定分析、鉴定产品特性。按照《中国药典》三部2005年版的有关规定进行了其他项目检查。结果:用建立的方法对重组人白介素12成品及原液进行检定,结果各项指标均符合《中国药典》的要求。结论:建立了重组人白介素12的质量标准,并可有效地控制制品的质量。

重组人白介素-12生物学活性检测方法的建立

目的建立重组人白介素-12(rhIL-12)的生物学活性检测方法。方法采用重组人白介素-12刺激外周血淋巴细胞分泌IFN-γ,并用国际标准品校正,进行生物学活性检测。结果用该方法对重组人白介素-12成品及原液进行检测,成品比活性平均值为1037460IU/mg,变异系数为26·0%(n=5);原液比活性平均值为1262270IU/mg,变异系数为16·8%(n=5)。结论该方法检测结果准确、客观,重复性好,可用于重组人白介素-12生物学活性的常规检测。

重组人白介素-12在银纹夜蛾中的表达纯化及其生物活性

KB细胞经PDBu刺激 ,采用异硫氰酸胍一步法提取细胞总RNA ,RT PCR法获得重组人白介素 12 (rhIL 12 )P35和P4 0cDNA。将hIL 12P35cDNA和P4 0cDNA分别克隆到 pAcUW 5 1载体的Polyhedrin和P10启动子下游 ,构建 pAcUW 5 1 IL12转移载体。pAcUW 5 1 IL12与坏死缺陷型线性苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒基因DNA共转染Sf9细胞 ,获得重组杆状病毒Ac hIL12。该病毒经血腔感染银纹夜蛾幼虫 ,采用亲和层析法纯化rhIL 12 ;SDS PAGE(银染法 )、Westernblot鉴定表达和纯化的产物 ;ELISA检测rhIL 12含量 ;MTT法检测rhIL 12样品生物活性。rhIL 12分子量为 75kD。rhIL 12在Sf9细胞培养中表达水平为 17.8μg/10 6细胞 ;在银纹夜蛾幼虫中表达水平为 2 0 0 - 30 0mg/L血淋巴。纯化的重组rhIL 12样品对经PHA P激活的PBMC有明显的增殖活性 。

人IL-12/慢病毒重组体对结肠癌干细胞“干性”的影响

目的:构建并鉴定人白介素12(Interleukin-12,IL-12)-慢病毒过表达重组体,观察其在结肠癌干细胞(Cancerstem cell,CSCs)中的表达及其作用,为后续动物试验做准备。方法:PCR扩增pORF-hIL-12质粒获得IL-12基因,通过双酶切及连接后构建IL-12/慢病毒过表达重组体;分离鉴定结肠CSCs,将IL-12/慢病毒过表达重组体转染结肠CSCs建立IL-12过表达模型,检测IL-12在结肠CSCs的表达及对结肠CSCs"干性"的影响。结果:PCR、酶切鉴定及测序证实IL-12/慢病毒过表达重组体构建正确,流式细胞仪成功分选出CD133+CD44+SW480结肠CSCs,IL-12/慢病毒转染结肠CSCs后,RT-PCR及West-ern blot证实结肠CSCs培养上清均有IL-12表达,IL-12抑制结肠CSCs自我更新,促进其分化。结论:IL-12/慢病毒过表达重组体能在结肠CSCs中稳定表达并能抑制结肠CSCs自我更新及分化。