重组白细胞介素4受体(IL-4R)噬菌体单链抗体库构建及筛选

目的应用噬菌体展示技术构建重组白细胞介素4受体（IL-4R）噬菌体单链抗体（sc Fv）库,并从抗体库中进行筛选。方法利用重组人IL-4R（rh IL-4R）蛋白免疫BALB/c小鼠,提取总RNA,反转录PCR扩增V_H和V_L基因,经重叠延伸PCR扩增出带有限制性酶切位点的sc Fv,用限制性内切酶SfiⅠ和NotⅠ分别双酶切sc Fv和p CANTAB5E载体,利用T4连接酶进行连接,转入感受态细菌E.coli TG1中制备转化子;在培养基中培养得到噬菌体单链抗体库;通过3轮富集和筛选,选择抗原亲和力最强的克隆进行测序分析。结果经过3轮筛选,构建了库容为2×10~8的rh IL-4R单链抗体库,测序结果显示抗rh IL-4R蛋白sc Fv基因全长741 bp,编码247个氨基酸。通过VBASE2数据库分析,抗rh IL-4R蛋白的V_H和V_L基因序列都存在3个互补决定区和4个骨架区。结论成功构建了抗rh IL-4R蛋白噬菌体sc Fv库。

重组人白细胞介素-4对银屑病样小鼠模型的影响

目的观察重组人白细胞介素-4（rhIL-4）对银屑病样小鼠模型的影响。方法采用小鼠雌激素期阴道上皮和鼠尾鳞片表皮实验模型，不同组别的小鼠给以甲氨喋呤或不同剂量的rhIL-4，分别观察其对增生阴道上皮细胞有丝分裂和鼠尾鳞片颗粒层形成的影响。结果rhIL-4的3个剂量组均可抑制小鼠阴道上皮的有丝分裂，促进鼠尾鳞片颗粒层形成。结论提示rhIL-4具有促进银屑病样小鼠模型恢复的作用。

人白细胞介素4的原核表达、复性、纯化及生物学活性鉴定

用PCR方法从pORF-hIL4质粒中扩增重组人白细胞介素4(hIL-4)的基因,构建PQE60原核表达载体并诱导其目的蛋白的表达。对表达的目的蛋白的可溶性进行鉴定,发现hIL-4基因表达产物在大肠杆菌中主要以不溶性包涵体形式存在,经过超声波破细菌、包涵体提取、洗涤处理后,用5mol/L盐酸胍变性溶解包涵体沉淀,上清稀释复性后透析,再经镍亲和层析进行纯化。纯化后的hIL-4进行TF-1细胞体外增生实验检测其生物学活性后,可用于人外周血树突状细胞的体外诱导培养。

大肠杆菌表达的重组hIL-4的分离纯化

对大肠杆菌表达的重组人白细胞介素 4进行了分离纯化。人 IL- 4基因表达产物在大肠杆菌中以不溶性包含体形式存在 ,经过超声破菌、包含体抽提、洗涤处理 ,可使包含体纯度达 70 %以上 ,用 6mol/L盐酸胍变性溶解包含体沉淀后上清直接稀释复性 ,再经浓缩、透析、离子交换色谱一系列纯化步骤终产物纯度达 95 %以上 ,回收率 1 0 %以上 ,比活性达 2 .5× 1 0

人外周血树突状细胞的体外诱导和鉴定

目的 :建立从人外周血体外诱导扩增树突状细胞 (DC)的方法。方法 :从正常人外周血白细胞分离单个核细胞 ,经三种细胞因子———重组人粒细胞 巨噬细胞集落刺激因子 (rhGM CSF)、重组人白细胞介素 4 (rhIL 4 )和重组人肿瘤坏死因子 (rhTNFα)联合诱导培养 ,10天后收获细胞 ,利用光学显微镜、透射电镜观察其外部形态和细胞超微结构 ,流式细胞仪检测其细胞表面抗原 ,自体混合淋巴细胞反应检测其刺激T细胞的增殖活性。结果 :培养收获了高纯度的DC ,这些细胞表面有大量的不规则突起 ,核也呈不规则状 ,核仁小 ,核膜异染色质聚集 ,含有丰富的细胞器 ,如核糖体、内质网、溶酶体等 ;细胞表面高水平表达HLA DR、CD1α、CD80、CD83和CD86 ;自体混合淋巴细胞反应表明诱导所得的DC具有很强的激发同种T细胞增殖的能力。结论

慢性乙型肝炎患者外周血树突状细胞表型及抗原提呈能力与HBV载量的关系

目的 探讨慢性乙型肝炎 (CHB)患者外周血树突状细胞 (DCs)表型及抗原提呈能力与HBV载量的关系。方法 采集 2 3例CHB患者和 8例健康人的抗凝外周静脉血 ,分离外周血单个核细胞 (PBMCs) ,在重组人白细胞介素 4和重组人粒细胞 巨噬细胞集落刺激因子的作用下培养使DCs增殖、成熟 ,以间接免疫荧光流式细胞技术分别检测DCs表面CD80、CD86、HLA DR及ICAM 1的表达 ;将培养成熟的DCs与HBsAg共同孵育 ,用丝裂霉素C处理后再与自体PBMCs共同培养 ,在培养结束前 12h加入3H TDR ,收集细胞 ,以 β液闪计数仪测定cpm值 ;同期用定量聚合酶链反应技术测定CHB患者外周血HBV载量。结果 患者DCs表面CD86、HLA DR和ICAM 1的表达水平及DCs的抗原提呈能力均显著低于健康对照组 ;CD80、CD86、HLA DR及ICAM 1的表达与HBV载量呈显著负相关 (分别为P <0 .0 1,P <0 .0 1,P <0 .0 0 1和P <0 .0 0 1) ;DCs的抗原提呈能力也与HBV载量呈显著负相关 (为P <0 .0 0 1)。结论 CHB患者外周血DCs的成熟和功能存在障碍 ,DCs的抗原提呈能力与血液中HBV的载量密切相关 。

脐血及外周血树突状细胞的体外诱导及比较研究

目的 :体外诱导扩增具典型形态、表型及功能的树突状细胞 (DC) ,以进行相关基础研究及临床应用。方法 :取正常人外周血及脐血 ,以 Ficoll分离取白细胞 ,去除悬浮细胞后 ,分别在以加入 GM- CSF,TNF-α(脐血 )及GM- CSF,IL- 4 (外周血 )的完全培养基中培养 ,在第 3,7,9天表型 (CD1a,CD80 ,CD83,HL A- DR)分析及形态观察 ,1周左右分别做同种异体混合淋巴细胞培养 ,比较激发细胞增殖的能力。结果 :脐血诱导的 DC细胞数大于外周血来源的 DC细胞数 ,两者有显著差异。两种来源的 DC在形态及细胞表型 (第 9天 CD1a脐血 6 7.2± 3.6 % ,外周血 6 9.3± 6 .8% ;CD83脐血 73.7± 5 .5 % ,外周血 75 .6± 4 .9% )无显著差异 ,两者的刺激同种异体淋巴细胞增殖能力无显著差异。结论 :脐血可成功诱导功能性 DC,脐血诱导比外周血诱导效率高 ,且与外周血所诱导的

人外周血树突状细胞的分离培养及鉴定

目的从外周血中分离单个核细胞 ,经体外诱导培养获取高纯度的树突状细胞。方法淋巴细胞分离液分离外周血的单个核细胞 ,经贴壁 2h后加入GM CSF、IL 4诱导 7天 ,观察细胞形态 ,用流式细胞仪检测其表面标志 ,采用混合淋巴细胞培养法检测其刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力。结果经诱导生成的细胞具有典型的DCs形态特征 ,高表达CD83 、CD86和MHCⅠ、Ⅱ类分子 ,在体外能诱导强烈的同种异体淋巴细胞增殖反应。结论本研究所建立的经济、简便的从外周血获取大量成熟DCs的方法 ,为DCs的进一步研究奠定了基础。

急性髓系白血病细胞诱导分化生成树突状细胞的研究

目的 将急性髓系白血病 (AML)原代细胞诱导成树突状细胞 (DC) ,并探索白血病免疫治疗的新途径。方法 分离初诊AML患者 12例和正常人 6例的骨髓单个核细胞 ,用重组人粒单核细胞集落刺激因子 (rhGM CSF) 10 0 0U /ml、重组人白细胞介素 4(rhIL 4) 50 0U/ml和肿瘤坏死因子α(TNF α) 50U/ml联合培养 10d ;经形态学 (Wright染色、倒置显微镜、透射电镜 ) ,免疫学 (CD80 、CD86 、CD83 、CD1a、HLA DR)鉴定 ,荧光原位杂交 (FISH)进行细胞遗传学分析 ,混合淋巴细胞反应检测功能。结果 细胞因子联合诱导后 ,呈现DC的典型形态 ,CD80 、CD86 、CD83 、CD1a的表达与对照组比较明显上调 (P <0 0 5) ,具有刺激T淋巴细胞增殖的能力。经FISH证实来源于白血病细胞的这类DC与正常DC在形态和免疫学表达方面相似 (P >0 0 5) ,但功能较弱。结论 在体外可成功的将AML原代细胞诱导分化成DC 。

膀胱癌患者外周血树突状细胞的体外培养扩增和鉴定

目的研究膀胱癌患者外周血树突状细胞(DC)的体外培养扩增和鉴定。方法应用Ficoll-Hypaque离心获得界面细胞,贴壁培养2h,获得单个核细胞,体外以重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF,50ng/ml)+重组人白细胞介素4(rhlL-4,10ng/ml)+人肿瘤坏死因子-α(hTNF-α,50ng/ml)诱导培养。倒置相差显微镜及扫描电镜下观察DC生长情况；流式细胞仪检测DC表型；MTT法检测DC活化的T细胞对肿瘤细胞BIU87的杀伤率。结果第6天体外培养的DC由贴壁状态变为悬浮毛刺状细胞,第8天为形态不规则的毛刺状,为典型DC形态。流式细胞仪检测表明,成熟DC高水平表达CD_(1a)、CD_(83)、CD_(86)及HLA-DR等。被DC激活的T细胞对膀胱癌细胞株BIU87的杀伤率为(48.8±3.7)%,未经DC激活的T细胞的杀伤率为(25.7±1.5)%,2组比较差异有统计学意义(P＜0.01)。结论膀胱癌患者外周血经rhGM-CSF+rhIL-4+hTNF-α体外诱导培养能诱导出DC。