新型纳米睫状神经营养因子复合物玻璃体腔注射对食蟹猴眼部的安全性——形态学评价

目的评估一种新型纳米神经营养因子复合物(NP-CNTFs)在非人灵长类动物眼内应用的安全性。方法利用纳米工艺制备包裹睫状神经营养因子(CNTF)的纳米粒。选取3只成年雄性食蟹猴,单眼玻璃体腔注射10μl NP-CNTFs(1μg/μl)作为NP-CNTFs组,对侧眼注射等体积磷酸盐缓冲液作为对照组。在注射前、注射后第3天和第7天,对食蟹猴行常规眼前节检查以评估结膜充血、前房闪辉及前房细胞等眼部症状并评分;采用彩色眼底照相观察眼底情况;采用频域光学相干断层扫描(SD-OCT)检测视网膜形态结构及厚度。结果所制备NP-CNTFs粒径为(317±3)nm,多分散性指数为0.042±0.015,Zeta电位为(-38.9±0.7)mV,具备较好的稳定性、生物利用度和生物相容性。眼前节检查显示,NP-CNTFs组在注射后第3天表现出较对照组稍明显的结膜充血、前房闪辉和前房细胞,但在注射后第7天基本恢复正常。NP-CNTFs组与对照组注射后第3天眼前节症状评分分别为(2.67±0.88)和(1.00±0.58)分,注射后第7天分别为(0.67±0.33)和(0.33±0.33)分,组间比较差异均无统计学意义(t=2.50、1.00,均P>0.05)。彩色眼底照相结果显示,NP-CNTFs组和对照组在注射后第7天眼底均正常,未见玻璃体混浊、玻璃体出血、视网膜出血或视盘水肿等异常改变。SD-OCT结果显示,NP-CNTFs组和对照组在注射后第7天均未见明显视网膜组织学改变。NP-CNTFs组和对照组视网膜神经纤维层厚度分别为(107.67±0.88)和(111.00±3.22)μm,黄斑中央凹厚度分别为(255.67±2.03)和(254.67±3.84)μm,组间比较差异均无统计学意义(t=1.43、0.50,均P>0.05)。结论新型纳米药物NP-CTNFs在食蟹猴眼内应用的安全性较好。

重组人睫状神经营养因子对糖尿病大鼠胃肠功能的影响

目的评价重组人睫状神经营养因子(rhCNTF)对糖尿病大鼠胃肠道功能的作用。方法采用链脲佐菌素(strepto- zocin,STZ)诱发的糖尿病大鼠胃肠神经功能紊乱模型,肌注rhCNTF 0.1,0.3,0.9mg·kg^(-1),测定了rhCNTF对血糖、胃肠慢波电位、小肠壁内神经蛋白含量,观察了rhCNTF对胃肠推进功能的影响以及胃肠对乙酰胆碱(Ach)、阿托品敏感性的影响。结果肌内注射rhCNTF对血糖无明显影响,也未见rhCNTF改善十二指肠对Ach、阿托品的敏感性。肌注RhC- NTF可改善糖尿病大鼠胃肠慢波电位、提高了胃肠推进功能、增加了胃肠壁内神经蛋白含量。结论糖尿病导致的胃肠神经功能紊乱可以通过肌注rhCNTF而改善,其重要机制是rhCNTF对抗糖尿病引起的胃肠神经病变。

重组睫状神经营养因子对周围神经再生中多种细胞的作用

为了解重组睫状神经营养因子 ( CNTF)对周围神经再生中多种细胞的作用 ,用硅管套接切断的成年大鼠坐骨神经 ,在受损神经局部一次性给予重组睫状神经营养因子 :用免疫组织化学 ABC法结合计算机图像分析观测再生神经中 GAP-4 3、S10 0、CD68、MHC- 免疫反应阳性物质的变化。与生理盐水对照组相比 ,证明 CNTF组再生神经中上述四种物质显著增多。结果提示重组睫状神经营养因子能促进轴突的再生、Schwann细胞的迁入。

外源性重组人睫状神经营养因子抑制成人成肌细胞的体外分化

为探讨外源性重组人睫状神经营养因子(rhCNTF)在成肌细胞分化中的作用,实验观察了0-10 ng/mlrhCNTF对成人成肌细胞体外分化的影响。结果表明,与对照组相比,2.5-10 ng/ml rhCNTF能显著抑制成肌细胞的体外分化(P<0.01),并呈量-效依赖关系,且这种抑制作用是可逆的。Western Blot分析提示,这种抑制作用伴有成肌细胞分化期特异标志myogenin和p21表达量的显著降低(P<0.01),以及成肌细胞增殖期特异标志myf5和desmin表达量的显著增加(P<0.01)。因此可以认为,外源性rhCNTF能可逆地抑制成人成肌细胞的体外分化并保持增殖。

乳糖诱导重组人睫状神经营养因子在大肠杆菌中的可溶性表达

目的利用乳糖替代IPTG,诱导重组人睫状神经营养因子(Recombinanthumanciliaryneurotrophicfactor,rhC-NTF)在原核工程菌BL-TCS中可溶性表达,并选择最适的诱导表达条件。方法在不同的温度下,利用不同浓度的乳糖及0·5mmol/L的IPTG,诱导含有人CNTF基因的工程菌9h,比较菌体生长、乳糖消耗以及目标蛋白的表达规律。结果乳糖组的菌体A600值均高于IPTG组。乳糖诱导产生的rhCNTF主要以可溶形式表达,各浓度乳糖的诱导效果均能接近或超过IPTG的效果。以2%乳糖在25℃下诱导6h,可以达到比较好的诱导效果。结论乳糖可取代IPTG诱导人CNTF基因表达,并获得良好效果。

重组睫状神经营养因子对受损周围神经施万细胞相关基因表达的作用

目的 研究重组睫状神经营养因子 (CNTF)对受损周围神经施万细胞基因表达的作用。 方法 用硅管套接切断的大鼠坐骨神经 ,在受损神经局部给予重组CNTF ,术后用免疫组织化学ABC法结合计算机图像分析观测S10 0蛋白 (S10 0 )、生长相关蛋白 4 3(GAP 4 3)、磷酸化酪氨酸 (PTyr)、信号转导子和转录激活子 (STAT) 3的免疫反应阳性物质在修复侧远段神经的分布和相对含量。 结果 CNTF组修复侧远段神经相应区域S10 0、GAP 4 3、PTyr、STAT3阳性物质的含量显著或非常显著高于生理盐水组。 结论 重组CNTF能上调受损神经施万细胞S10 0、GAP 4 3、PTyr和STAT3的表达 ,提示重组CNTF通过强化受损神经施万细胞JAK STAT途径 ,上调其S10 0和GAP 4 3的基因表达。

重组人睫状神经营养因子突变体的构建、表达及生物活性分析

目的:通过对原始CNTF的突变改造,降低表达蛋白的免疫原性,同时增加其稳定性,以期能用于临床治疗肥胖症。方法:以原始CNTF为模板,去掉N端的12个氨基酸、C端的14个氨基酸,并将C端末2个氨基酸点突变为极性较强的赖氨酸,在大肠杆菌中表达,获得CNTF-T突变体。结果:基因序列分析与原设计吻合,目的蛋白表达量占全菌体的35%左右,表达蛋白以包涵体形式存在,经变性、复性、DEAE-FF纯化,纯度可达95%以上,小鼠体内生物活性测定,能明显抑制小鼠体重增长,且CNTF-T的生物活性比原始序列CNTF的活性高。结论:突变的CNTF-T有望成为新一代的生物减肥制剂应用于临床。

重组人睫状神经营养因子的复性研究

利用凝胶层析对人睫状神经营养因子原核基因工程产品进行复性研究， 发现此方法的复性率高于稀释透析法． 而且在复性的同时也进行了一步纯化工作． 该方法简单、迅速、高效、重复性好， 可用于规模生产．

人重组睫状神经营养因子对大鼠视神经不全损伤后功能恢复的影响

目的 探讨人重组睫状神经营养因子 (recombinanthumanciliaryneurotrophicfactor,rhCNTF)对大鼠视神经不全损伤后功能恢复的作用。方法 采用无创血管夹在成年鼠造成视神经不全损伤 ,治疗组玻璃体腔内注射rhCNTF ,对照组注射等量双蒸水。在损伤前、损伤后即刻及伤后 1、2、4、8和 12周检测伤眼闪光视觉诱发电位。结果 视神经损伤后即刻 ,闪光视觉诱发电位波形几近熄灭。伤后 1周 ,潜伏期 (LP1) 2组基本恢复至损伤前水平 ,与损伤前比较无显著性差异 (P >0 .0 5 ) ,组间比较无显著性差异 (P >0 .0 5 )。振幅 (AP1 N2 )恢复缓慢 ,伤后 1～ 2周治疗组与对照组比较无显著差异 (P >0 .0 5 ) ;4周以后 2组间差异非常显著 (P <0 .0 1)。 8周时对照组恢复至损伤前的30 .84 % ,而治疗组恢复至 5 0 .35 % .

重组人睫状神经营养因子肽图分析

建立重组人睫状神经营养因子(recombinant human ciliary neurotrophic factor,rhCNTF)的肽图分析方法,用于rh-CNTF的质量控制。胰蛋白酶对rhCNTF进行酶切后,利用RP-HPLC方法对酶切液进行分析,以获得胰蛋白酶切最佳条件及色谱条件,并对连续3批样品进行分析。rhCNTF的胰蛋白酶最佳酶切条件为37℃酶切24h,以A(0.1%TFA-H2O)、B(0.1%TFA-CH3CN)为流动相,采用梯度洗脱的方法对酶切液进行分析,结果连续3批rhCNTF制备产品的肽图完全一致,且其检出峰数目与理论推测值相符。3批产品肽图的一致性为rhCNTF产品的结构同一性提供了有利证据,同时,建立了rhCNTF产品质量控制的一项指标。

重组人睫状神经营养因子干预家兔视神经损伤动物模型视神经蠕变特性的分析

以蠕变特性指标研判重组人睫状神经营养因子干预动物视神经损伤的效果。以钳夹法复制动物视神经损伤模型,以重组人睫状神经营养因子连续干预30 d后,对各组动物进行视觉电生理检测,之后取各组动物视神经进行组织形态观察和蠕变实验。视神经损伤模型以重组人睫状神经营养因子干预治疗组Pl峰值大于视神经损伤模型组,差异显著(P<0.05)。以重组人睫状神经营养因子干预治疗组视神经纤维结构尚存,较少部分视神经纤维排列不规则,视神经无明显变细,视神经损伤模型组兔视神经纤维束结构消失,神经纤维和胶质细胞变性、坏死。视神经损伤以重组人睫状神经营养因子干预治疗组7 200 s应变上升量大于视神经损伤模型组组、差异显著(P<0.05)。以重组人睫状神经营养因子干预治疗动物视神经损伤模型后视神经的织形态、蠕变特性等得到较大的恢复。

重组人睫状神经营养因子衍生物的构建、表达和活性分析

采用PCR定点突变技术对睫状神经营养因子(CNTF)基因进行改造,获得了CNTF衍生物(CNTF-D)基因序列分析证明其核苷酸序列符合设计要求,并在大肠杆菌中获得高效表达,CNTF-D表达量超过40%,复性后,经Q-Sepharose HP纯化,其纯度超过95%,体内法测定发现能明显降低实验小鼠的体重。表明CNTF-D在体内具有良好的生物学活性,为下游开发奠定了基础。

重组人睫状神经营养因子对大鼠坐骨神经再生长的影响

目的:观察重组人睫状神经营养因子(CNTF)对大鼠坐骨神经再生长的影响,并与神经生长因子(NGF)的作用进行比较。方法:随机将动物分成正常对照组、模型组、CNTF给药小剂量组(48μg/kg)、中剂量组(216μg/kg)、大剂量组(1080μg/kg)、NGF给药组(20μg/kg),每组各10只。模型组采用大鼠坐骨神经切断再缝合法造成坐骨神经损伤模型,给药组采用不同药物剂量对神经损伤部位肌肉注射给药45d后,测定神经动作电位潜伏期和传导速度。结果:与模型组相比较,CNTF各给药组神经动作电位潜伏期显著缩短(P<0.01),传导速度显著增快(P<0.01);同时,216μg/kg、1080μg/kgCNTF组和NGF组对神经动作电位潜伏期的影响无显著差别(P>0.05),但是216μg/kg、1080μg/kgCNTF组的神经动作电位传导速度比NGF组显著增快(P<0.01)。结论:CNTF对大鼠坐骨神经再生具有一定的促进作用,而且其作用可能优于NGF。

大鼠坐骨神经修复后重组睫状神经营养因子对相关神经元生长相关蛋白43、生长抑素表达的影响

目的观察周围神经修复后,重组睫状神经营养因子(CNTF)对相关神经元中生长相关蛋白表达的调控作用。方法用硅管套接切断的成年大鼠坐骨神经,在神经切断处给予重组CNTF,用免疫组织化学和原位杂交组织化学方法结合计算机图像分析观测L4脊髓和L4、L5脊神经节中生长相关蛋白-43(GAP-43)和生长抑素(SOM)mRNA的相对含量。结果在CNTF组修复侧脊髓前角外侧核,大、中型神经元胞质中神经元GAP-43阳性物质的面积百分率显著高于生理盐水组,SOMmRNA杂交信号阳性的大、中型神经元的数量少于生理盐水组,但两组脊神经节的相应指标无显著差别。结论坐骨神经修复后,外加重组CNTF能上调相关运动神经元表达GAP-43,下调其表达SOMmRNA,但对感觉神经元的相应作用不明显。

重组人睫状神经营养因子的聚乙二醇化修饰

目的:研究重组人睫状神经营养因子(rhCNTF)突变体的聚乙二醇(PEG)化修饰,对rhCNTF的PEG化产物进行初步分离纯化及相关生物活性检测。方法:采用分子生物学技术经点突变得到rhCNTF的突变体CN10,通过实验设计研究CN10的最佳PEG化条件;采用分子筛层析方式对偶联产物进行初步纯化,最后用ELISA和小鼠体重增长抑制法检测PEG化后的CN10蛋白的生物活性。结果:能运用mPEG-MAL对CN10进行定点修饰,PEG化后用Superdex200能够分离CN10;PEG化后的CN10每2 d腹腔注射1次,对小鼠体重的增长抑制率可达50%,与rhCNTF每天注射2次的体重增长抑制作用相当。结论:CN10蛋白在PEG化修饰后,其减重效应持续时间明显延长。

凝胶法和动态浊度法检测注射用重组人睫状神经营养因子中细菌内毒素含量

目的采用凝胶法和动态浊度法检测注射用重组人睫状神经营养因子(CNTF)中细菌内毒素含量,控制制品质量,消除临床热原反应的发生。方法供试品参照《中华人民共和国药典》(2010年版)三部附录ⅫE细菌内毒素检查法中的凝胶法和动态浊度法要求进行检查。结果注射用重组人睫状神经营养因子溶液在100μg/mL质量浓度下,确定内毒素限值为10 EU/mL。凝胶法和动态浊度法检查后,注射用重组人睫状神经营养因子内毒素含量均符合规定。结论凝胶法和动态浊度法可用于注射用重组人睫状神经营养因子的细菌内毒素检查。

重组人睫状神经营养因子的表达及其临床前药效学研究

目的:人睫状神经营养因子(hCNTF)是神经营养因子(NGF)家族以外的一种神经营养因子,具有明显的减轻体重的作用。为了将hCNTF的研究逐步推向应用,开展了hCNTF减肥作用的临床前相关研究。方法:依据国内减肥药临床前药效学指导原则,设计并实施了动物实验,建立了各种指标与人类肥胖最为相似的肥胖SD大鼠模型,分别测定了重组hCNTF用药后大鼠的体重、血清三酰甘油、总胆固醇、肾周围脂肪重量和肥胖指数。结果:在200μg/(kg·d)剂量下,重组hCNTF对减轻肥胖SD大鼠体重、减轻其右肾周围脂肪及改善体型都有一定的效果;400μg/(kg·d)以上剂量的重组hCNTF,对减轻肥胖SD大鼠体重、改善体型、降低血清三酰甘油都有极其显著的效果;惟有剂量达到1600μg/(kg·d),重组hCNTF才能降低血清总胆固醇含量。结论:所获得的重组hCNTF在肥胖SD大鼠动物模型上具有十分良好的减肥效果。

基因重组人睫状神经营养因子单克隆抗体的制备及初步鉴定

目的 制备基因重组人睫状神经营养因子 (rhCNTF)单克隆抗体。方法利用rhCNTF免疫BALB/C小鼠 ,取其脾细胞与小鼠NS -1骨髓瘤细胞融合 ,制备 3株抗rhCNTF的单克隆抗体 ,分别命名为CA2 、CA6 和BB11。结果 3株抗体类型均为IgG2a,免疫印迹试验证明为特异性抗CNTF的单克隆抗体 ;抗体相加试验表明 3株单抗是针对CNTF两个不同的抗原决定簇。

重组人睫状神经营养因子对大鼠胶质细胞瘤C_6细胞系生长的影响

本研究观察了重组人睫状神经营养因子（ｒｈＣＮＴＦ）对大鼠胶质瘤Ｃ６细胞系生长的影响。发现ｒｈＣＮＴＦ２０～２０００ｎｇ／ｍｌ可抑制Ｃ６细胞增殖，细胞形态发生明显改变，且具有剂量─时间效应。此外，ｒｈＣＮＴＦ还可诱导Ｃ６细胞分泌少量ＩＬ─６。结果表明，ｒｈＣＮＴＦ对Ｃ６细胞的抑制作用可能与其参与瘤细胞的生长调节有关，推测ｒｈＣＮＴＦ作为一种细胞调节因子对胶质瘤具有潜在治疗作用。

重组人睫状神经营养因子蛋白质定量检测方法的建立

采用ELISA双抗体夹心法,建立一种快速灵敏的定量检测rhCNTF成品蛋白含量的方法。结果显示,rhC-NTF抗原浓度在(0～25)ng范围内线性良好(r>0.99),灵敏度为0.3ng/ml,与其他重组细胞因子无交叉反应,样品的检测结果与理论含量相吻合,CV<15%,该方法检测速度快、重复性好、灵敏度高、特异性好。