重组人类肝细胞生长因子对胶质瘤细胞增殖及VEGF表达的影响

目的探讨重组人类肝细胞生长因子(rhHGF)对胶质瘤细胞增殖及血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响。方法用5、10、20、30μg/L不同浓度的rhHGF作用于体外培养的U251胶质瘤细胞并设立空白对照组,甲基噻唑基四唑(MTT)法检测细胞增殖;免疫组化及Westernblot检测增殖细胞核抗原(PCNA)和VEGF表达。结果与对照组相比,rhHGF明显促进U251细胞的增殖和生长,其作用呈时间效应关系和一定浓度范围内的剂量效应关系(P<0.05)。Westernblot及免疫组化检测显示,20μg/LrhHGF作用后U251细胞PCNA和VEGF表达上升,呈时间依赖性(P<0.05);细胞外调节蛋白激酶(ERK)抑制剂PD98059呈剂量依赖性抑制rhHGF诱导的PCNA和VEGF表达增加。结论rhHGF可能通过ERK信号途径促进胶质瘤细胞增殖和VEGF表达,从而影响胶质瘤的生长和血管发生。

敲低趋化因子受体3通过减弱Wnt/β-catenin信号通路抑制肝母细胞瘤细胞增殖与迁移

目的 探讨CXC趋化因子受体3 (CXC chemokine receptor 3,CXCR3)在肝母细胞瘤(hepatoblastoma,HB)中的作用及机制。方法 收集16例HB组织及其癌旁组织,用免疫组化与Western blot法检测CXCR3蛋白的表达。HB细胞(Huh-6及HepT1)分别转染Con-shRNA、CXCR3-shRNA1和CXCR3-shRNA2后,将其分为Con-shRNA组、CXCR3-shRNA1组和CXCR3-shRNA2组。CCK-8法和EdU染色法检测细胞增殖,划痕法和Transwell法检测细胞迁移与侵袭,Western blot法检测β-连环蛋白(β-catenin)、c-Myc、细胞周期蛋白D1 (cyclin D1)、基质金属蛋白酶(metallomatrix proteinase,MMP)7及MMP-9的表达。裸鼠异位移植;肿瘤实验检测各组细胞体内成瘤情况及瘤体体积,并用免疫组化检测瘤体组织中MMP-9和Ki67表达。结果 CXCR3在HB组织中表达上调(P<0.01)。与Con-shRNA比较,CXCR3-shRNA1组和CXCR3-shRNA2组Huh-6及HepT1细胞活力、增殖、迁移及侵袭能力均降低(P<0.01),Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达减弱(P<0.01),细胞移植瘤的瘤体生长缓慢且体积明显缩小(P<0.01),瘤体组织中MMP-9和Ki67表达降低(P<0.01)。结论 下调CXCR3可抑制HB细胞的增殖与迁移,其机制可能与减弱Wnt/β-catenin信号有关。

重组肝刺激因子对肝脏卵圆细胞增殖的作用

目的 观察重组人肝刺激因子 (hHSS)对肝脏卵圆细胞增殖的影响。 方法 分离大鼠肝卵圆细胞 ,加以培养 ,并进行细胞学鉴定。将重组的hHSS作用于肝脏卵圆细胞 ,以MTT法、流式细胞术观察其对卵圆细胞的增殖作用。 结果 实验分离的卵圆细胞同时表达肝细胞和胆管细胞特异性标志物。给予重组hHSS作用 1 2～2 4h后 ,细胞增殖速度减缓 ,细胞DNA合成减弱 ,其作用的最有效浓度为 2 4 0mg L。 结论 重组hHSS能抑制卵圆细胞的增殖。

AlkB同源蛋白5去除前mRNA加工因子6的mRNA甲基化修饰调控肝细胞癌的细胞增殖

目的探讨AlkB同源蛋白5(AlkBhomolog5,ALKBH5)在肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma,HCC)的细胞增殖中的作用。方法通过癌症基因组图谱数据库分析ALKBH5和前mRNA加工因子6(pre-mRNA processing factor 6,PRPF6)在HCC组织中的表达水平。采用实时荧光定量聚合酶链反应和蛋白质印迹法检测ALKBH5和PRPF6在HCC细胞系(Huh7和Hep3B)中的mRNA和蛋白表达水平。荧光原位杂交确定ALKBH5和PRPF6在HCC细胞系(Huh7和Hep3B)中的亚细胞定位。在免疫沉淀复合物中检测PRPF6的N6-甲基腺苷甲基化水平。通过过表达和敲低基因表达的方法,将Huh7细胞和Hep3B细胞分别进行转染,分组为sh-NC组(阴性对照转染细胞)、sh-ALKBH5实验组(ALKBH5干扰序列转染细胞)、sh-ALKBH5+ex-PRPF6实验组(ALKBH5干扰序列转染+PRPF6 pcDNA 3.1过表达质粒转染细胞),并采用CCK-8和染色增殖试验检测各组细胞的增殖情况。裸鼠异种移植瘤实验验证ALKBH5和PRPF6在体内的生物学功能。蛋白质印迹法检测各组细胞中AKT/mTOR通路相关蛋白的表达水平。结果HCC细胞中ALKBH5的表达上调,可以去除PRPF6的甲基化修饰。体外和体内实验结果显示,ALKBH5可通过调节PRPF6的表达参与HCC细胞的恶性增殖。此外,敲低ALKBH5会抑制丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(serine-threonine kinase,AKT)和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)的磷酸化,而PRPF6的过表达则有助于AKT和mTOR的磷酸化。结论ALKBH5能促进HCC细胞的增殖,相关机制是通过ALKBH5/PRPF6/AKT/mTOR轴实现的。

人类重组肝细胞生长因子影响膀胱癌细胞株生长和抑制丝裂霉素C诱导细胞凋亡的研究

目的 :观察人类重组肝细胞生长因子 (rhHGF)对膀胱移行细胞癌T2 4细胞增殖和丝裂霉素C(MMC)诱导的细胞凋亡的影响。方法 :以T2 4细胞为研究材料 ,用不同浓度rhHGF干预T2 4细胞生长及MMC诱导的细胞凋亡作用。利用MTT实验、流式细胞仪技术来判定rhHGF对细胞增殖和凋亡的影响。结果 :不同浓度rhHGF组间 ,T2 4相对增殖细胞数差异无统计学意义 (P >0 .0 5 ) ;rhHGF预处理后 ,MMC诱导的T2 4细胞凋亡率明显下降 ,在一定范围内有量效关系。结论 :HGF并不显著诱导T2 4细胞增殖 ,而一定剂量范围内的HGF能抑制MMC诱导的细胞凋亡 ,可能与膀胱癌的复发。

清肝降脂汤对体外诱导非酒精性脂肪肝细胞模型脂代谢和过氧化物酶体增殖物激活受体-α的调节作用研究

目的:探讨清肝降脂汤对体外诱导非酒精性脂肪肝(NAFLD)细胞模型脂代谢和过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)-α的调节作用。方法:取HepG2细胞株,采用油酸构建NAFLD细胞模型。将细胞分为正常对照组(无油酸建模+无药物处理)、模型对照组(有油酸建模+无药物处理)和清肝降脂汤组(有油酸建模+有药物处理)。采用CCK-8实验检测细胞活性。采用油红O染色定性定量检测清肝降脂汤对细胞内脂质的影响,定量计算脂质含量的抑制率。同时,测定细胞内丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)和游离脂肪酸(FFA)含量;并采用聚合酶链反应(PCR)和Western blot检测脂肪代谢标志物PPAR-α和成纤维细胞生长因子-21(FGF21)的表达水平。结果:与正常对照组相比,模型对照组的HepG2细胞活性显著增高,脂质含量显著增高,MDA、SOD、TG、TC和FFA含量显著增高,而PPAR-α和FGF21表达水平显著降低(均P<0.05);而与模型对照组相比,清肝降脂汤组的HepG2细胞活性显著降低,脂质含量显著降低,MDA、SOD、TG、TC和FFA含量显著降低,而PPAR-α和FGF21表达水平显著增高(均P<0.05)。结论:清肝降脂汤有助于降低HepG2细胞活性、脂质含量以及MDA、SOD、TG、TC和FFA含量,并促进PPAR-α和FGF21表达,进而调节脂质代谢,抑制NAFLD发展进程。

肝纤维化病程中Kupffer细胞分泌的细胞因子对肝星状细胞活化增殖、凋亡的调控

肝纤维化是对慢性肝损伤的愈合反应,为一个可逆的过程。肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)是肝脏分泌细胞外基质(extra cellular matrixc,ECM)的主要细胞,在肝纤维化的发展机制中占有重要的地位。如何控制HSC的活性并逆转肝纤维化的进程是抗肝纤维化研究的重点之一。在肝纤维化病程中,一系列细胞因子通过旁分泌和自分泌方式作用于邻近的HSC,影响其增殖、趋化、代谢及凋亡。鉴于Kupffers细胞为细胞因子的主要来源,其在肝纤维化病程中对HSC细胞的活化增殖、凋亡发挥着重要的调控作用。HSC、Kupffers细胞及细胞因子与肝纤维化的发生发展关系极为密切,阐明其关系,有助于以HSC为靶点的肝纤维化方面的研究,现就其关系综述如下。

重组人内抑素对佐剂性关节炎大鼠滑膜细胞增殖及产生细胞因子的影响

目的观察重组人内抑素对体外培养佐剂性关节炎大鼠滑膜细胞的增殖功能及产生细胞因子的影响,探讨其治疗佐剂性关节炎的作用机制。方法采用弗氏完全佐剂(CFA)诱导的佐剂性关节炎(AA)大鼠模型,用足容积法测量关节肿胀度;采用collagenasetypeⅡ消化法分离、培养滑膜细胞,MTT法检测重组人内抑素体内用药对滑膜细胞增殖的影响;放免法检测滑膜细胞上清液中IL-1β、TNF-α的含量。结果CFA致炎后d10,AA大鼠出现继发性炎症,此时皮下注射重组人内抑素(1·25,2·5,5mg·kg-1),连续7d,对照组于d10给予MTX(1·0mg·kg-1)。各剂量组能明显抑制AA大鼠的继发性足肿胀;重组人内抑素体内用药可明显减少AA大鼠滑膜细胞数量,抑制滑膜细胞的增殖,并呈剂量依赖关系;各剂量组均可明显抑制AA大鼠滑膜细胞产生过高的IL-1β和TNF-α。结论重组人内抑素抑制AA大鼠滑膜细胞过度的增殖及过高的细胞因子是其治疗AA的途径之一。

阻断肝再生增强因子的表达对人肝癌细胞株HepG2增殖的抑制作用

背景与目的:前期研究中已发现人肝再生增强因子(humanaugmenterofliverregeneration,hALR)在肝癌细胞中呈高表达,在正常肝细胞中几乎不表达,并在体外能刺激肝癌细胞株增殖,而对正常肝细胞无影响。本研究通过运用hALR的siRNA和hALR单克隆抗体阻断人肝癌细胞株HepG2表达,探讨hALR对细胞增殖的影响。方法:设计、构建siRNA表达质粒pSIALR-A及其阴性对照质粒pSIALR-B。将构建的pSIALR-A和pSIALR-B分别转染HepG2细胞。荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达,以计算转染效率。转染48h后,免疫细胞化学及RT-PCR法检测HepG2细胞中hALR的表达。用3H-TdR掺入法检测hALR的siRNA和特异性单克隆抗体对HepG2细胞增殖的影响。结果:HepG2细胞中有hALR的表达。成功构建了针对hALR基因编码区的siRNA表达质粒pSIALR-A。转染入细胞后发现,pSIALR-A能明显抑制hALR的表达(mRNA的表达量减少83%),而随机序列的siRNA却无此作用。hALR的siRNA在体外能显著抑制人肝癌细胞株HepG2增殖,分别转染质粒pSIALR-A和pSIALR-B后HepG2细胞的cpm值为67687±6548和104807±5713(P<0.05)。抗hALR单克隆抗体特异性地阻断hALR的作用后,可部分抑制肿瘤细胞自主性生长(P<0.05)。结论:HepG2细胞高表达hALR;针对hALR的siRNA能显著、特异性地抑制hALR表达,进而抑制HepG2细胞的生长。抗hALR单克隆抗体也能部分抑制HepG2细胞自主性生长。

重组人肝刺激因子的促增殖和抗损伤作用

目的 探讨重组人肝刺激因子 (hHSS)的生物学特性并观察其抗损伤能力。 方法 以MTT法、细胞计数、细胞周期分析和MAPK活性观察hHSS促细胞增殖作用。以H2 O2 损伤细胞 ,观察hHSS保护细胞的作用。 结果 重组hHSS能刺激BEL 74 0 2肝癌细胞增殖 ,促进增殖信号分子MAPK的磷酸化。hHSS可增强细胞对抗H2 O2损伤的能力 ,促进受损细胞DNA合成。 结论 HSS为一种新的生物活性蛋白 。

肝再生增强因子对大鼠脾单个核细胞增殖及IL-2产生能力的影响

目的:通过体外实验探讨rALR对脾脏单个核细胞是否具有直接的免疫调控作用和作用特点。方法:以3H-TdR掺入法检测脾脏单个核细胞在不同处理情况下的增殖状况:①不同剂量的rALR与5μg/ml ConA同时加入;②5μg/ml ConA预刺激脾脏单个核细胞10和32小时后,再加入30μg/ml rALR;③30μg/ml rALR预处理脾脏单个核细胞至30小时,再加5μg/ml ConA刺激。以环孢霉素A作为阳性对照,以转空质粒的酵母表达上清提取物作为阴性对照。以放免法检测培养上清中IL-2分泌情况。结果:不同剂量的rALR与ConA同时加入时,能以剂量依赖方式明显抑制ConA对脾脏单个核细胞的促增殖作用。ConA预刺激脾脏单个核细胞10、32小时后,再给予30μg/ml rALR仍可明显抑制脾脏单个核细胞的增殖,但用30μg/ml rALR预处理脾脏单个核细胞至30小时,并不影响脾脏单个核细胞对ConA刺激的反应能力。ConA+rALR(30μg/ml)组的IL-2分泌在24小时明显低于ConA组。结论:rALR对ConA活化的脾脏单个核细胞增殖有明显的抑制作用,而对未活化的脾脏单个核细胞则无明显影响,提示未经抗原激活的免疫细胞可能不表达ALR受体。

细胞因子对3T3细胞、肝细胞及贮脂细胞增殖的影响

肝纤维化是各种急慢性肝病的主要病理转归，肝间质细胞及实质细胞均参与了纤维化过程并受多种因素调控，细胞因子是其中重要的调节因子之一。研究了ＴＮＦα、ＩＬ－１、ＩＬ－６、ＩＦＮＴ对３Ｔ３、肝细胞、贮脂细胞增殖活性的影响，发现上述四种因子均能不同程度的促进细胞增殖，并与剂量有关。结果提示细胞因子在纤维化早期有重要调节作用。

姜黄素联合人类细胞因子诱导的杀伤细胞对卵巢癌细胞增殖的抑制作用及其机制

目的:观察姜黄素(Cur)联合人类细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞在体外对人卵巢癌浆液性囊腺癌细胞SKOV-3的增殖抑制作用,探讨其协同抗肿瘤作用及其可能机制。方法:诱导脐血CIK细胞,将SKOV-3细胞随机分为Cur组、CIK细胞组和Cur联合CIK细胞组,MTT法测定各组细胞的增殖抑制率,RT-PCR检测各组细胞Fas相关死亡结构蛋白Fas、Fas相关死亡结构蛋白(FADD)和Caspase-3mRNA的表达。结果:与Cur组和CIK细胞组比较,Cur联合CIK细胞组SKOV-3细胞增殖抑制率增大,并且随时间的延长或剂量的增加,增殖抑制率亦增加,在效靶比为12.5∶1,20μmol·L-1 Cur作用48h时,SKOV-3细胞增殖抑制率达到76.2%;Cur联合CIK细胞组与Cur组和CIK细胞组比较,SKOV-3细胞Fas及Caspase-3的mRNA表达水平增加(P<0.05),Cur组、CIK细胞组和Cur联合CIK细胞组SKOV-3细胞FADD-mRNA表达无明显变化。结论:CIK细胞与Cur合用具有协同抗肿瘤作用,其效应可能与促进SKOV-3细胞Fas及Caspase-3的mRNA表达有关。

表皮生长因子受体信号通路调控人肝细胞癌细胞增殖分子机制的研究

目的:研究人肝细胞癌中表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)的表达及其细胞内信号转导通路,探讨EGFR在促进肿瘤细胞增殖中的作用。方法:用免疫组化实验检测癌组织中EGFR的表达;用EGF和AG1478处理人肝癌细胞HuH7;用Western blot法检测EGFR、p-EGFR、p-ERK蛋白表达;用WST法检测细胞增长率。结果:17例HCC患者癌组织中,EGFR的阳性表达率为100%;HuH7中EGFR的表达明显高于正常肝细胞HL-7702。外源性EGF(10μg/L)处理后,ERK和EGFR的磷酸化水平提高,同时细胞生长率提高9.2%,而此作用能被AG1478(20μmol/L)阻断。结论:人肝细胞癌中,EGFR高表达,EGFR的激活主要通过受体磷酸化完成,活化的p-EGFR可能通过ERK/MAPK下游信号通路传递信息,调控人肝细胞癌的发生发展。

肝细胞增殖因子促进受损肝细胞增殖的可能机制

目的:探讨肝细胞增殖因子(ALR)促进受损肝细胞增殖的可能机制。方法:采用细胞增殖试验(MTT法)观察经ALR刺激的大鼠肝枯否细胞(KC)的条件培养液(KCCM+)对受损肝细胞增殖的影响,同时用免疫组织化学方法检测正常大鼠肝脏组织中ALR的分布、大鼠枯否细胞膜表面结合的ALR以及ALR对枯否细胞IL-6表达的影响。结果:受损肝细胞经枯否细胞条件培养液刺激后增殖明显。正常大鼠肝细胞内可表达合成ALR,枯否细胞膜表面可见ALR免疫反应颗粒,经ALR刺激后枯否细胞IL-6免疫反应信号增强。结论:ALR可能通过首先刺激枯否细胞,从而促进受损肝细胞增殖。

肝细胞生长因子对冠状动脉平滑肌细胞增殖迁移的影响

为观察肝细胞生长因子(HGF)对牛冠状动脉平滑肌细胞(BCASMC)增殖、迁移的影响,分离和培养BCASMC,采用四甲基偶氮唑蓝法观察HGF对BCASMC增殖的作用,倒置显微镜观察BCASMC的迁移。结果显示,对照组、HGF组BCASMC的D值相差显著(P<0.05),HGF组的BCASMC增殖率为45.2％,且迁移明显。提示HGF能促进BCASMC的增殖和迁移。

肝细胞生长因子对牙髓细胞增殖的影响

目的探讨肝细胞生长因子对牙髓细胞生长增殖的影响。方法以体外培养的牙髓细胞为实验对象,以不同浓度肝细胞生长因子作用于牙髓细胞,通过二甲基噻唑二苯基四唑溴盐比色法对细胞的增殖情况进行研究,用流式细胞术对细胞的周期进行分析。结果1～200μg L的肝细胞生长因子可明显促进牙髓细胞的增殖(P<0.05),100μg L为最大效应浓度。100μg L的肝细胞生长因子作用牙髓细胞3d对其细胞周期无显著性影响,作用5d缩短了G1期,增加了S期比例。结论肝细胞生长因子对牙髓细胞的增殖有促进作用。

肝细胞生长因子促血管内皮细胞增殖及迁移的研究

目的探讨重组人肝细胞生长因子(rhHGF)对人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)增殖和迁移的影响及其促血管生成作用。方法从脐静脉体外分离培养HUVEC,采用四甲基偶氮唑蓝法(MTT)观察rhHGF对HUVEC的增殖作用,倒置显微镜观察HUVEC的迁移,透射电镜观察超微结构的改变及流式细胞仪检测细胞周期的改变。结果(1)rhHGF对培养的HUVEC有显著的促增殖和迁移作用,且成浓度和时间依赖性。(2)rhHGF促使HUVEC细胞超微结构的改变,线粒体和粗面内质网增多,常染色质增多(3)细胞周期分布改变S期、G2/M期细胞增多。结论rhHGF能显著促进HUVEC的增殖和迁移,提示其可能具有促血管生成作用。

肝细胞生长因子对人外泌汗腺上皮细胞促增殖作用的研究

目的研究肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)对培养的人外泌汗腺上皮细胞(human eccrinesweat gland epithelial cells,hESGc)的促增殖作用,以及细胞内磷酸化细胞外信号调节激酶(phosphorylated extracellular signal-regulated kinase1/2,p-ERK1/2)蛋白的表达。方法在无血清角质形成细胞培养基(keratinocyte serum free medium,KSFM)中培养hESGc,取第1代细胞进行实验。免疫组织化学染色检测C-met表达。MTT法检测HGF对hESGc的促增殖作用,实验分为3组:空白组、对照组和实验组。空白组仅含200μL KSFM;对照组于96孔板以2×103个/孔接种hESGc,并加入200μLKSFM;实验组于96孔板以2×103个/孔接种hESGc并加入200μLKSFM后,再分别加入不同浓度(2、20、40、80ng/mL)HGF。实验组于加入各浓度HGF前以及加入后2、4d,观察细胞增殖情况。实验组于加入40ng/mL HGF后即刻,5、30、90和120min,采用Westernblot方法检测细胞内p-ERK1/2表达规律。结果hESGc抗-C-met免疫组织化学染色胞浆可见阳性染色,细胞核染色为蓝色。MTT法检测示40、80ng/mL HGF对hESGc具有显著促增殖作用(P<0.05)。在含40ng/mL HGF的KSFM中培养2d,吸光度(A)值为0.2393±0.0709,增殖率为74.2%,对照组A值为0.1374±0.0290;培养4d,40ng/mL HGF实验组A值为0.2878±0.0743,增殖率为74.8%,对照组A值为0.1646±0.0350,两组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。在含80ng/mL HGF的KSFM中培养2d,A值为0.2123±0.0592,增殖率为54.5%;培养4d,80ng/mL HGF实验组A值为0.2310±0.0567,增殖率为40.3%;与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。p-ERK1/2在40ng/mL HGF刺激5min后表达达高峰,相对积分吸光度值(relative integral absorbance,RIA)为0.5932±0.1922,较刺激后即刻增加8.1倍(P<0.01);刺激30、90及120min后RIA与刺激后即刻比较,差异无统计学意义(P>0.05)结论HGF可促进hESGc增殖,并能引起ERK1/2蛋白磷酸化。