重组人粒细胞集落刺激因子生物学活性标准品的免疫学活性测定

目的测定重组人粒细胞集落刺激因子 (rhG CSF)生物学活性标准品的免疫学活性。方法用深圳晶美公司及美国R&D公司的G CSFELISA试剂盒分别对WHOrhG CSF生物学活性国际标准品、惠尔血针剂 75 (GRAN 75 )及用WHOrhG CSF生物学活性国际标准品标定过生物学活性的工作标准品T1、T2、T3进行免疫学活性测定。结果不同公司的rhG CSFELISA试剂盒对所测定样品的测定结果不同 ,且用不同稀释液稀释样品测定结果亦不同。结论用免疫学方法定量测定rhG CSF的含量是有条件的 ,且免疫反应能识别聚体但不能识别蛋白分子的降解。

重组人粒细胞集落刺激因子生物学活性工作标准品的标定

目的用世界卫生组织 (WHO)粒细胞集落刺激因子 (G CSF)生物学活性国际标准品对所制备的重组人粒细胞集落刺激因子 (rhG CSF)生物学活性工作标准品以及惠尔血 针剂 75进行标定。方法用NFS 6 0细胞采用MTT法进行rhG CSF生物学活性的测定 ,(4 ,4)法计算测定结果。结果制备rhG CSF生物学活性工作标准品 3批 ,两批为冻干剂 ,与G CSF生物学活性国际标准品配方一致 ,一批为水剂 ,与惠尔血 针剂 75配方一致 ;用G CSF生物学活性国际标准品对其标定 ,结果依次为 3.0 6 2× 10 6、4.2 76× 10 6IU/支及 1.6 35× 10 7IU/ml,样品为1.880× 10 7IU/ml。标定结果的FL %分别为 5 .5 2 9%、4.2 91%、4.2 44 %及 5 .175 %。结论所标定的rhG CSF生物学活性工作标准品可用于rhG CSF生物学活性测定。

重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子活性测定标准品的研制

目的 :建立效价测定用的重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子 (GM CSF)国家标准品。方法 :标准品按WHO有关要求进行制备、分装、冻干、检测 ,用GM CSF国际标准品为标准进行协作标定。结果 :冻干重组GM CSF标准品经检测外观 ,无菌实验合格 ,水分为 0 .93% ,加速热稳定实验表明其生物学活性在温度为 - 2 0℃ ,4℃和 2 5℃ ,37℃条件下 2 3个月保持稳定。该标准品经 3家实验室协作标定共 2 1次测定 ,几何平均效价为 1.77× 10 5IU/支。实验均数的 95 %可信区间为(1 6 4～ 1.90 )× 10 5IU/支 ,单次实验的 95 %参考值范围为 (1.2 3～ 2 .34 )× 10 5IU/支 ,平均可信限率为 6 .96 2 %。结论 :该批重组GM CSF国家标准品各项指标均符合要求 ,可作为国家标准品使用 ,效价定为 1.8× 10 5IU/支 ,编号为 98/ 0 1。

重组人粒细胞集落刺激因子活性测定标准品的研制

目的 建立效价检测用的重组人粒细胞集落刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）国家标准品。方法 标准品按 ＷＨＯ有关要求进行制备、分装、冻干、检测，用Ｇ－ＣＳＦ国际标准品为标准进行协作标定。结果 冻干重组人Ｇ－ ＣＳＦ标准品经检测，外观、无菌实验合格，水分为０．９０％，加速热稳定实验表明其生物学活性在－２０、４和２５℃条件 下２０个月保持稳定。该标准品经４家实验室协作标定共３２次测定，加权平均效价为 ５．１５×１０６ＩＵ／支；几何平均效 价为 ４．９１×１０６ＩＵ／支。实验均数的９５％可信区间为４．６４×１０６～５．２０×１０６ＩＵ／支，单次实验的９５％参考值范围为 ３．４５×１０６～６．４７×１０６ＩＵ／支，平均可信限卒为５．４６％。结论 该批重组人Ｇ－ＣＳＦ国家标准品各项指标均符合要 求，可作为国家标准品使用，效价定为５．０×１０６ＩＵ／支，编号为９８／０１。

聚乙二醇修饰重组人粒细胞集落刺激因子的生物学活性验证

通过细胞集落实验和体外活性实验,对聚乙二醇化重组人粒细胞集落刺激因子(PEG-rhG-CSF)和重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)的体外生物学活性进行对照验证,为临床应用提供理论依据.通过小鼠骨髓瘤细胞集落实验研究PEG修饰前后rhG-CSF因子对细胞集落形成的影响;按照药典(2015版)标准,采用新型染剂CCK-8、MTS和原染剂MTT,对PEG-rhG-CSF和rhG-CSF进行体外生物学活性的测定.结果显示,PEG-rhG-CSF对小鼠骨髓瘤细胞集落形成的作用明显强于rhG-CSF(P<0.05),集落数目多(38.5±4.2个),集落大且密集;新型染剂CCK-8在体外生物学活性的测定效果最好,R^2超过0.995,曲线拟合更好,在最适体外生物活性范围内(0.1~400 IU·mL^(-1)),PEG-rhG-CSF吸光度值(0.75±0.027)明显高于rhG-CSF(0.36±0.036).聚乙二醇修饰在体外药效方面显示了更强的长效特征,对体外生物学活性有增强效应,重复性良好,回收率较高.

重组人粒细胞集落刺激因子的表达、纯化以及PEG修饰

重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)经大肠杆菌温度诱导表达后,其表达产物以包涵体形式存在,包涵体经过变性、复性和分离纯化等步骤处理后得到纯化的rhG-CSF。在一定的实验条件下用单甲氧基聚乙二醇活性酯(mPEG20k-NHS)对rhG-CSF进行化学修饰,所得修饰产物经分离纯化后获得PEG20K-rhG-CSF偶联物。与修饰前的rhG-CSF相比较,尽管修饰后的rhG-CSF体外生物学活性下降至修饰前的20%左右,但其在体内的作用时间能够得到显著的延长,药效有了明显提高。

重组人粒细胞刺激因子生物学活性国家标准品的制备及协作标定

目的制备重组人粒细胞刺激因子(recombinant humna granulocyte colony-stimulating factor,rhG-CSF)生物学活性国家标准品,并进行协作标定。方法 rhG-CSF原液中加入冻干保护剂制备待标品,进行外观、无菌检查及水分、生物学活性检测。将待标品置-20、4、25、37℃分别保存1、2和3个月,取样,检测相对生物学活性,评价热加速稳定性。组织国内5家实验室对待标品进行协作标定。结果制备的待标品灌装变异度<1%,其外观、水分、无菌、生物学活性检查结果均符合相关要求;热加速稳定性试验结果拟合Eyring方程为:ln{k(t)}=18.49-7 853/T+ln(T),R^(2)=0.880,预测待标品于-20℃贮存时,生物学活性衰减10%约需111个月;于-30℃贮存时,生物学活性衰减10%约需417个月。5家实验室协作标定制备的待标品赋值为4.2×10^(6) IU/支。结论制备的rhG-CSF生物学活性国家标准品具有良好的稳定性,可用于rhG-CSF制品的质量评价。

重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)成品蛋白质含量测定及比活性分析

目的:通过对重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)样品蛋白质含量测定及比活性分析,来评价rhG-CSF的质量,为在rhG-CSF成品质量标准中增加蛋白含量测定从而提高我国rhG-CSF的质量标准提供依据。方法:通过从市场和企业库房中随机抽样的方式获得供试品,应用NFS-60细胞/MTT比色法检测供试品的生物学活性;应用HPLC法检测供试品的蛋白质含量;然后计算供试品中rhG-CSF的比活性(即生物学活性与蛋白质含量之比)。结果:本次供试品来自北京、上海、浙江、福建等7省市,共计18批次的样品。按2005年版中国药典三部rhG-CSF NFS-60细胞/MTT比色法测定,18批供试品生物学活性平均相对标示量为115.5%。结果均符合规定,用新建立的HPLC法检测样品中蛋白含量,18批制品蛋白含量测定结果为标示量的93%～137%,平均值为标示量的(118.5±13.6)%。除有1批次样品比活性低于该类制品原液药典要求(应不低于6.0×107IU.mg-1),其余17批供试品均符合其原液比活性要求,平均比活性为7.5×107IU.mg-1。结论:已上市rhG-CSF比活性总体情况较好,但有个别批次比活性可能存在问题,为保证rhG-CSF质量,有必要在其质量标准中增加成品蛋白含量测定项目。

冻存对复溶后人粒细胞刺激因子国家标准品生物学活性的影响

目的探讨冻存对复溶后人粒细胞刺激因子(human granulocyte colony-stimulating factor,hG-CSF)国家标准品生物学活性的影响,为hG-CSF国家标准品的使用提供参考。方法依据《中国药典》三部(2020版)通则3525测定标准品的生物学活性;将复溶后的hG-CSF国家标准品分装后置于-80、-40、-20℃保存,分别于第1、2、3、5和6个月取样检测生物学活性,用临用前复溶的标准品定量-80℃存放不同时间的标准品,以-80℃存放的样品为100%活性对照品定量其余样品的相对生物学活性。结果热加速稳定试验拟合Eyrlng方程为:ln{k(t)}=6.75-3772.20/T+ln(T),R2=0.969,预测hG-CSF国家标准品于-80℃贮存时,生物学活性衰减5%约需93.4个月;-80℃冻存的复溶标准品生物学活性值下降约24%。结论hG-CSF国家标准品复溶分装后于-80℃可稳定保存半年以上。但冻融会引起活性值下降超过20%,因此不建议复溶后分装储存使用。

重组人粒细胞集落刺激因子-Fc融合蛋白(rhG-CSF-Fc)的质量研究

目的:建立重组人粒细胞集落刺激因子-Fc融合蛋白的质控方法和质量标准。方法:采用NSF-60细胞增殖法测定生物学活性;非还原SDS-PAGE电泳和RP-HPLC测定纯度;以ELISA法分别测定残留CHO细胞蛋白和蛋白A;其余检测项目按中国药典2010年版三部规定进行。结果:用建立的方法对重组人粒细胞集落刺激因子-Fc融合蛋白原液和成品进行了检定,各项指标均符合《人用重组DNA制品质量控制技术指导原则》和中国药典2010年版三部的要求。结论:建立的质控方法和质量标准具有保证产品安全有效、质量可控的特点,可用于该类产品的常规检定。

rhG—CSF瑞白（重组人粒细胞集落刺激因子注射液）

齐鲁制药有限公司采用世界先进的基因重组技术，经长期反复试验比较，在各种G—CSF生产体系中，选择最佳表达体系，生产出质量与进口同类产品完全相同的产品，商品名为瑞白。它具有高度均一性，与人体内天然G—CSF具有完全相同的生物学活性，可有效控制由于癌症化疗、放疗等各种原因所致的粒细胞减少症。

恒河猴粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的基因合成、原核表达及纯化

目的人工合成恒河猴粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(Macaca mulatta granulocyte-macrophage colony stimulatingfactor,mGM-CSF)基因,在大肠杆菌中高效表达并纯化。方法根据大肠杆菌遗传密码子偏爱性优化设计并合成mGM-CSF基因,克隆至原核表达载体pET-43.1a(+)中,构建重组表达质粒pET-43.1a-mGM-CSF,转化大肠杆菌BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL,IPTG诱导表达。表达的重组mGM-CSF蛋白经Sephacryl S-200分子筛层析纯化,复性后,Western blot检测其反应原性,MTT法检测其生物学活性。结果重组表达质粒pET-43.1a-mGM-CSF经双酶切及测序证实构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为15 000,表达量约占菌体总蛋白的30%,主要以包涵体形式存在;纯化复性后的重组蛋白纯度可达95%以上,并可与大鼠抗人GM-CSF单克隆抗体特异性结合,比活性为1.2×107IU/mg。结论在大肠杆菌中高效表达了重组mGM-CSF蛋白,纯化复性后的蛋白具有良好的生物学活性。