重组人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体对家兔纤溶和凝血系统活性的影响

目的 :观察重组人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体 (reteplase ,Ret)对家兔纤溶和凝血系统活性的影响。方法 :采用常规方法测定家兔血液纤溶和凝血系统相关参数指标。结果 :Ret(3.75、7.5 0、15 .0MIU·kg-1)可明显降低纤溶酶原含量 ,使血浆纤维蛋白降解产物转呈阳性反应 ,缩短优球蛋白溶解时间 ,同时延长血浆凝血酶时间 ,凝血酶原时间及活化部分凝血活酶时间。结论

重组人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体的溶栓作用及对血小板聚集和胞浆游离钙离子浓度的影响

目的 研究重组人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体(reteplase,Ret)的溶栓作用以及对离体家兔血小板聚集功能和对血小板静息状态胞浆内游离钙浓度的影响。方法 家兔血栓模型采用动-静脉旁路法,血小板聚集实验采用比浊法,血小板静息状态胞浆内游离钙浓度采用Fura-2荧光测定法。结果Ret(3.75×105,7.50× 105,15.0×105U·kg-1)对家兔动-静脉旁路所形成的血栓有明显溶栓作用,可明显减轻血栓干湿重量,并呈一定的剂量依赖性。Ret(1 000,3 000,10 000 U·mL-1)对ADP诱导的血小板聚集可产生浓度依赖性的抑制作用,并可明显降低血小板静息状态的[Ca2+]i,并呈一定的浓度依赖性。结论Ret具有明显的血栓溶解作用,可明显抑制ADP诱导的血小板聚集,并明显降低血小板静息状态的[Ca2+]i。

重组人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体对猕猴的长期毒性研究

目的 观察重组人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体(reteplase,Ret)的长期毒性作用。 方法 连续 14d给猕猴静脉注射不同剂量Ret。结果 Ret 8 0MIU·kg-1对猕猴不表现任何毒性作用 ,Ret 2 5 0、80 0MIU·kg-1组的血液RBC、HGB及HCT均降低 ,部分猕猴粪便隐血试验阳性 ,血液生化学检查有TP下降 ,但这些指标在停药 14d时基本恢复正常。另外 ,所有给药猕猴出血时间均延长 ,但脏器系数和病理学未见有毒性变化。结论 Ret静脉注射 8 0MIU·kg-1是安全剂量 ,2 5 0、80 0MIU·kg-1两个剂量有一定的毒性反应 ,主要表现为贫血和出血 ,停药后毒性可以恢复。

重组人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体对犬冠状动脉血栓的溶栓作用

目的观察重组人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体(reteplase)对犬冠状动脉血栓的溶栓作用。方法实验用杂种犬,设溶剂对照组r、eteplase 100×104、50×104和25×104IU/kg 4组。手术分离冠状动脉左旋支(LCX),以血管内膜粗糙+电刺激法形成冠状动脉左旋支血栓,检测静脉注射不同剂量reteplase后对冠状动脉左旋支血流量、栓塞再通率、心肌梗死范围、伤口失血量和末梢出血时间的影响。结果静脉注射reteplase可使栓塞的冠状动脉血管很快出现再通,血流量显著增加,心肌梗塞范围明显缩小,明显增加伤口出血量,延长末梢出血时间,rete-plase各剂量组与溶剂对照组比较均有显著差别(P<0.001)。结论reteplase对犬冠状动脉血栓具有显著的溶栓作用。

重组人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体基因的克隆及工程菌的构建与鉴定

利用RT PCR技术,从人脐带静脉上皮细胞中克隆人组织型纤溶酶原激活剂基因,将其接入TA克隆载体PCR2.1中,经DNA序列测定后,以该重组质粒DNA为模板,用PCR方法获得了人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体(K2tPA)基因,将其转入pET29a,构建了重组表达质粒pET29a/K2tPA,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,构成工程菌.经IPTG诱导表达,在40kDa处有一明显表达条带,表达量为约占菌体总蛋白的20%.该菌种在贮存与复苏及传代过程中具有良好的质粒稳定性和表达稳定性.

重组人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体的工业化制备与性质研究

将含有人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体(K2tPA)重组表达质粒的工程菌经10L种子罐培养及100L发酵,IPTG诱导表达,其表达量为占菌体总蛋白的20%,表达产物经体外变复性、TI Sepharose亲和层析、SP Sepharose离子交换层析,每100L发酵液得重组人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体(K2tPA)纯品4g,纯度达95%以上,比活大于500000IU/mg,内毒素及热源含量、宿主蛋白残留量、宿主DNA残留量等均达到临床使用标准.其分子量(质谱测定)、氨基酸组成、N、C-端氨基酸序列分析等均与理论值相符.同时进行了等电点测定及肽图分析等性质研究.

重组人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体的药效学研究

犬静脉给予重组人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体(K2tPA)1×106IU/kg、5×105IU/kg、2.5×105IU/kg对冠脉血栓产生显著的溶栓效果,栓塞冠脉血管很快出现再通,高、中、低剂量组残存血栓较溶剂对照组分别减少了72.7%、55.6%、42.5%;心肌梗死范围明显缩小.血纤维蛋白原明显降解,凝血酶原时间、凝血酶时间及陶土激活部分凝血酶时间明显延长,但抗凝血酶活性无显著改变.伤口出血量增加,出血时间延长.以上指标与等剂量(5×105IU/kg)的德国BoehringerMannheimGmbH产品Retavase作用相似.离体家兔血小板凝集实验结果表明:重组人K2tPA对家兔血小板聚集功能具有明显的抑制作用.

重组人组织型纤溶酶原激活剂改构体复性研究

目的 研究重组人组织型纤溶酶原激活剂改构体(reteplase)体外复性。方法 通过研究复性所需的时间、温度、pH值、蛋白浓度、氧化还原对比例和添加精氨酸等因素,确定了reteplase复性所需的基本条件,并对直接稀释法、氧化复性后再稀释和脉冲稀释法进行了方法学比较研究。结果 脉冲稀释法优于直接稀释法和氧化复性后再稀释。结论建立了reteplase复性方法,此方法可使重组蛋白在较高的重折叠浓度下仍具有良好的复性效率。

重组人组织型纤溶酶原激活剂改构体的表达、复性与分离纯化

目的 获得具有高纯度、高生物活性的重组人组织型纤溶酶原激活剂改构体(瑞替普酶,reteplase,r-PA)。方法 reteplase基因克隆到表达质粒pJZ-100中,转化Escherichia cli B121(DE3),在0.05 mmol·L-1异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导下获得高效表达,表达产物通过脉冲稀释法复性,复性后的蛋白质用ETI-Sepharose 4B亲和色谱纯化。结果 表达产物占菌体总蛋白质的20％,脉冲稀释法复性后复性收率为28％,经纯化后纯度达96％以上,比活为580 000 IU·mg-1。结论 建立了reteplase表达、复性与纯化工艺,以此工艺可获得高活性高纯度的reteplase。

两种剂量重组组织型纤溶酶原激活剂对急性肺栓塞患者临床疗效及预后情况的影响比较

目的探讨两种剂量重组组织型纤溶酶原激活剂对急性肺栓塞患者临床疗效及预后影响性。方法前瞻性选取仙桃市第一人民医院收治的急性肺栓塞患者86例,随机分为对照组和研究组,各43例。对照组予高剂量(0. 9kg/mg)重组组织型纤溶酶原激活剂治疗,研究组予低剂量(0. 6 kg/mg)治疗。观察两组患者治疗前、治疗后凝血功能、临床症状、血管内皮功能、血液学指标变化并比较。结果①两组治疗后脑利钠肽(BNP)、D-二聚体(D-D)、肌酸磷酸激酶(CK)、肌酸磷酸激酶同工酶(CK-MB)、肌钙蛋白T(c Tn T)、肌钙蛋白I(c Tn I)较治疗前均显著降低(P <0. 05),但研究组与对照组比较差异无显著性(P>0. 05)。②两组治疗后纤维蛋白原、纤维蛋白降解产物、α2-抗纤溶酶、纤溶酶原较治疗前均显著下降(P <0. 05),但研究组与对照组比较差异无显著性(P>0. 05),而两组治疗前、治疗后凝血因子XⅢ、血小板比较差异无显著性(P> 0. 05)。③两组治疗后可溶性细胞间黏附因子1(s ICAM-1)、内皮素1(ET-1)、血栓素B2(TXB2)较治疗前均显著下降,6醛前列腺素FIa(6-k-PGFIa)、一氧化氮(NO)较治疗前均显著升高(P<0. 05),但研究组与对照组比较差异无显著性(P> 0. 05)。④两组治疗完成后胸痛、晕厥、咯血、呼吸困难发生率较治疗前均显著降低(P <0. 05),但治疗后两组发生率比较差异无显著性(P> 0. 05)。⑤研究组在颅内出血、粪便潜血(+)、尿潜血(+)、皮肤黏膜出血、脑血管事件发生率上显著低于对照组,差异有统计学意义(P <0. 05)。结论低剂量重组组织型纤溶酶原激活剂治疗急性肺栓塞疗效与高剂量相当,但出血等并发症发生率低。

重组人组织型纤溶酶原激活剂改构体质控方法的建立

目的建立重组人组织型纤溶酶原激活剂(tissue type plasminogen activator,tPA)改构体(TNK-tPA)的质控方法。方法采用气泡法测定TNK-tPA原液的生物学活性,非还原SDS-PAGE和RP-HPLC法测定其纯度,还原型SDS-PAGE确定其相对分子质量,HPLC-SEC法测定其单链含量,胰酶裂解法分析其肽图,Edman降解法测定其N-末端氨基酸序列,毛细管等电聚焦电泳法测定其等电点,Lowrry法测定其蛋白质含量,地高辛法测定其外源DNA残留量。按《中国药典》三部(2005版)要求,对TNK-tPA成品进行鉴别试验及外观、pH值、水分含量、无菌、装量、异常毒性等检测。结果 3批TNK-tPA原液的生物学活性为(2.09～2.16)×106U/ml,比活性均大于3.5×105U/mg,因此确定TNK-tPA原液的比活性不得低于3.0×105U/mg。3批TNK-tPA原液的非还原型SDS-PAGE纯度均大于98.0%,RP-HPLC纯度均大于97.0%;经还原型SDS-PAGE分析可见两条带,相对分子质量分别为68 000和35 000;样品原液的单链含量为75.7%;3批TNK-tPA原液的肽图酶切图谱与理化参考品一致;TNK-tPA原液的N-末端氨基酸序列、等电点、蛋白质含量、外源DNA残留量及成品的鉴别试验结果、外观、pH值、水分含量、无菌、装量、异常毒性等均符合《中国药典》三部(2005版)要求。结论建立的质控方法可保证产品安全、有效、质量可控,可用于TNK-tPA产品的常规检定。

重组组织型纤溶酶原激活剂静脉溶栓对急性脑梗死患者血浆D-D二聚体的影响分析

急性脑梗死作为神经内科常见疾病之一,在中老年人中发病率较高,可以导致患者较高的致残率与死亡率。据研究报道早期溶栓治疗可以改善急性脑梗死患者的症状和预后,目前临床上应用较广泛的溶栓药物有尿激酶和重组组织型纤溶酶原激活剂。D-D二聚体作为一种可以反映血管中纤溶系统活化与凝血反应的分子标记物,可以判断溶栓治疗的效果及药物剂量的合理性。

健脑愈瘫汤联合针刺防治高血压合并缺血性脑卒中患者rt-PA静脉溶栓后出血性转化效果及对血浆MMP-9、D-二聚体和血压变异性的影响

目的观察健脑愈瘫汤联合针刺防治高血压合并缺血性脑卒中患者重组组织型纤溶酶原激活剂(rt-PA)静脉溶栓后出血性转化(HT)效果及对血浆基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、D-二聚体和血压变异性(HPV)的影响。方法将2016年1月—2019年1月中国人民解放军陆军军医大学士官学校附属医院收治的130例接受rt-PA静脉溶栓治疗的高血压合并缺血性脑卒中患者随机分为观察组65例和对照组65例,对照组给予常规神经内科治疗,观察组在对照组治疗基础上给予健脑愈瘫汤联合针刺治疗,疗程均为14 d。记录2组HT发生类型和发生率,并记录2组溶栓后不同时期血浆MMP-9、D-二聚体水平和HPV参数及预后情况。结果2组HT发生种类比较差异无统计学意义(P>0.05),观察组HT发生率9.2%(6/65)显著低于对照组20.0%(13/65),差异有统计学意义(P<0.05)。2组溶栓后24 h、溶栓后3 d的血浆MMP-9、D-二聚体水平均较溶栓前显著升高(P均<0.05),观察组在溶栓后14 d以上指标均低于溶栓前(P均<0.05),而对照组以上指标仍高于溶栓前(P均<0.05),观察组在溶栓后24 h至溶栓后14 d的以上指标均低于对照组(P均<0.05);2组溶栓后3 d、14 d的24 hSBP、24 hDBP、dSBP、dDBP、nSBP、nDBP均较溶栓后24 h显著降低(P均<0.05),观察组溶栓后3 d、14 d的以上指标均低于对照组(P均<0.05);2组溶栓后3 d、14 d的24 hSSD、24 hDSD、dSSD、dDSD、nSSD和24 hDSD均较溶栓后24 h显著降低(P均<0.05),观察组溶栓后3 d、14 d的以上指标均低于对照组(P均<0.05)。2组溶栓后24 h、3 d、14 d的NIHSS评分均明显低于溶栓前(P均<0.05),Barthel指数均明显高于溶栓前(P均<0.05),观察组溶栓后24 h、3 d、14 d的以上指标均优于对照组(P均<0.05)。结论健脑愈瘫汤联合针刺可显著降低高血压合并缺血性脑卒中患者rt-PA静脉溶栓后HT发生率,促进神经功能和日常活动能力恢复,其机制可能与下调血浆MMP-9、D-二聚体水平,降低HPV有关。

治疗深静脉血栓形成过程中活化蛋白C和D-二聚体的改变

目的观察深静脉血栓形成(DVT)发病时和两种治疗[尿激酶和重组组织型纤溶酶原激活剂 (rt-PA)]过程中活化蛋白C(APC)和D-二聚体(D-D)的变化及其意义。方法确诊的30例DVT随机分为:A组(15例),用尿激酶治疗;B组(15例),用rt-PA治疗。治疗过程中4次采血观察血浆APC和D-D水平。普通住院术前患者为对照组(10例),不采用药物治疗,入院时采血观察血浆APC和D-D水平。结果治疗前A、B组血浆APC水平与照组相比明显降低(P<0．01),血浆D-D水平则明显升高(P<0．01)。治疗过程中,A、B组血浆APC水平均明显升高;A组血浆D-D含量无明显变化(P>0．05),B组D-D含量明显降低(P<0．05),A组和B组之间的疗效无明显差异(P>0．05)。不同的发病时间其治疗效果有明显差异(P<0．05)。结论 APC和D-D对DVT有早期诊断价值;APC可能提示病情的严重程度,D-D无此作用。用常规剂量尿激酶和rt-PA治疗DVT的疗效无差异;治疗效果好的患者发病时间一般较短。

血清D-二聚体与急性缺血性脑卒中患者rt-PA静脉溶栓后早期神经功能改善及预后的关系

目的 分析经重组组织型纤溶酶原激活剂(rt-PA)治疗后的急性缺血性脑卒中(AIS)患者血清D二聚体水平与神经功能改善及预后的关系。方法 选取2016-01-2018-10泰州市人民医院收治的114例AIS患者,根据rt-PA治疗5d后美国国立卫生研究院卒中量表(NIHSS)评分较溶栓前的差值(ΔNIHSS)分为神经功能改善良好组(ΔNIHSS≥4分)和神经功能改善不良组(ΔNIHSS<4分),比较2组基础信息、血液生化指标、血压和入院时NIHSS评分等。记录rt-PA治疗后预后不良率,对单因素分析筛选出来可能影响患者早期神经功能改善的因素进一步进行Logistic回归分析,分析血清D二聚体水平与预后不良的关系。结果 89例患者被归为神经功能改善良好组,25例患者被归为神经功能改善不良组,2组糖尿病患病率、年龄、入院时NIHSS得分、空腹血糖、糖化血红蛋白、纤维蛋白原和D二聚体水平差异有统计学意义(P<0.05),多因素Logistic回归分析显示年龄较大、入院NIHSS评分较高和D二聚体水平高是神经功能改善的危险因素(P<0.05)。治疗90d后预后不良者为15例,预后良好者99例,后者的D二聚体显著低于前者,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 年龄较大、入院NIHSS评分较高和D二聚体水平高是rt-PA静脉溶栓治疗后神经功能改善的危险因素,血清D二聚体水平可能可以作为预测AIS患者预后的一个重要参考指标。

血浆内皮素-1、D-二聚体水平与老年急性脑梗死患者rt-PA静脉溶栓预后的关系

目的探究血浆内皮素(ET)-1、D-二聚体(D-D)水平与老年急性脑梗死(ACI)患者重组组织型纤溶酶原激活剂(rt-PA)静脉溶栓预后的关系。方法158例行rt-PA静脉溶栓的老年ACI患者接受治疗30 d后进行改良Rankin量表(mRS)评估,依据mRS评分分为预后不良组(mRS评分3~6分)71例、预后良好组(mRS评分0~2分)87例。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血浆ET-1、D-D水平;采用受试者工作特征(ROC)曲线评估血浆ET-1、D-D水平对静脉溶栓预后的诊断价值;Logistic回归分析静脉溶栓预后的影响因素。结果与预后良好组相比,预后不良组合并高血压比例、心房颤动比例、糖尿病比例、入院时美国国立卫生研究院脑卒中量表(NIHSS)评分,血浆ET-1、D-D水平均明显升高(P<0.05);血浆ET-1、D-D水平预测静脉溶栓不良预后的曲线下面积(AUC)分别为0.843、0.858,对应截断值分别为63.39 ng/L、269.14μg/L,此时灵敏度分别为81.7%、83.1%,特异度分别为74.7%、74.7%;两者联合预测不良预后的AUC为0.913,其灵敏度、特异度分别为91.5%、78.2%;高血压、心房颤动、入院时NIHSS评分、ET-1、D-D均是影响老年ACI患者rt-PA静脉溶栓后发生不良预后的危险因素(P<0.05)。结论老年ACI患者rt-PA静脉溶栓发生不良预后与高水平血浆ET-1、D-D相关,检测血浆ET-1、D-D水平有利于临床筛查预后不良患者。

依达拉奉联合rt-PA治疗对脑梗死患者的抗心磷脂抗体、内皮素-1和D-二聚体的影响

目的观察依达拉奉联合重组组织型纤溶酶原激活剂(rt-PA)治疗对脑梗死的疗效及其对机体抗心磷脂抗体(ACA)、内皮素-1(ET-1)和D-二聚体的影响。方法选择2011年1月至2013年12月住院急性脑梗死患者90例为对象,随机分为观察组和对照组,每组各45例。对照组予以rt-PA治疗,观察组在对照组的基础上予以依达拉奉治疗。观察两组的疗效,治疗前后美国国立卫生研究院卒中量表(NIHSS)和日常生活活动能力量表(ADL),ACA,ET-1和D-二聚体水平的变化。结果观察组的总有效率为93.33%明显高于对照组的75.56%,差异有统计学意义(χ2=4.145,P<0.05)。治疗后两组NIHSS评分、ET-1和D-二聚体水平较治疗前明显降低(P<0.01),观察组的降低水平更为明显(P<0.01);而两组治疗后的ADL评分均较治疗前明显升高(P<0.01),观察组的升高水平更为明显(P<0.01)。结论依达拉奉联合rt-PA治疗急性脑梗死疗效确切,可能通过调节机体的脑血管舒缩功能、减轻脑水肿,保护脑神经细胞,从而达到改善神经功能的作用。

SEC-HPLC法测定rhTNK-tPA单链含量

目的:测定重组人组织型纤溶酶原激活剂改构体(combinant human mutant-threonine mutant-asparagine mutant-lysine tissue type plasminogen activator,rhTNK-tPA)单链含量。方法:将样品用二硫苏糖醇(DTT)打开二硫键,采用分子排阻色谱(size-exclusion high performance liquid chromatograph,SEC-HPLC)法测定。色谱柱:Tsk-Gel2000SWxl;流动相:0.2 mol·L-1PB-0.1%SDS水溶液;流速:0.5 mL·min-1;检测波长:214 nm;柱温:23℃;检测时间:30 min。结果:试验精密度和重复性良好;分离度不低于1.1;3批rhTNK-tPA原液的单链含量分别为74.41%、75.39%、74.43%,3批成品的单链含量分别为73.82%、74.76%、74.91%。结论:本方法经方法学验证可用于rhTNK-tPA产品的常规检定。