重组人肝细胞生长因子α的纯化与活性测定

目的纯化重组人肝细胞生长因子α(rhHGFα)包涵体,复性并测定其活性。方法大肠杆菌中表达的rhHGF琢以包涵体形式存在,表达量约占菌体总蛋白的25%。离心分离包涵体,用8mol/L尿素溶解,梯度稀释复性。经SephadexG75凝胶过滤和POROSHQ阴离子交换纯化,噻唑蓝法(MTT)测定活性。结果rhHGF琢纯度达到90%以上,其刺激肝细胞生长的活性达到rhHGF标准品的80%。结论建立了纯化rhHGF琢的技术路线,rhHGF琢具有刺激原代培养大鼠肝细胞生长的作用。

重组人肝细胞生长因子-β链的高效表达及包涵体纯化研究

目的 构建重组人肝细胞生长因子 - β链 (rh HGF- β)的表达体系。筛选高效表达工程菌株 ,分离纯化 rh HGF- β。方法 用工程菌诱导培养技术筛选 rh HGF- β的高效表达菌株。从诱导起始时间、诱导时间、温度、p H值、培养基组分等方面优化 rh HGF-β的表达体系。进一步对 rh HGF-β进行粗纯化 ,采用超声波破菌 ,溶菌酶破菌 ,高速离心反复洗涤获得包涵体。采用凝胶过滤层析纯化 rh HGF-β。结果 经十二烷基硫酸钠 -多丙烯酰胺冻胶电泳 (SDS- PAGE)及扫描分析目的蛋白的表达量达 3 0 % ,经纯化后可获得纯度在 90 %以上的 rh HGF-β。结论 建立了高效稳定的 rh HGF- β表达体系 ,获得实验室水平 rh HGF-

重组人肝细胞生长因子的纯化及鉴定

目的对重组人肝细胞生长因子（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｏｒ， ｒｈＨＧＦ）进行初步纯化及鉴定。方法 培养上清液经过离心、超滤，在ＦＰＬＣ系统上经肝素亲和层析分离纯化，用ＥＬＩＳＡ法检测、收集ｒｈＨＧＦ。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电 泳鉴定纯度和相对分子质量，大鼠原代肝细胞培养法检测ｒｈＨＧＦ的生物学活性。结果ｒｈＨＧＦ主要在０．９～１．３ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ 范围内被洗脱，由约６２ ０００和３４ ０００两个亚基组成，明显促进大鼠肝细胞ＤＮＡ合成。结论 经肝素亲和层析分离，从 表达山ＨＧＦ的ＣＨＯ细胞培养上清液中纯化出有活性的ｒｈＨＧＦ。

重组人肝细胞生长因子真核表达的定性及定量检测

将人肝细胞生长因子 ( human hepatocyte growth factor ,h HGF)全长 c DNA重组入 p EE1 4真核稳定表达质粒 ,用 lipofectin脂质体将 p EE1 4 /rh HGF转染入 CHO-K1细胞 ,蛋氨酸亚氨基代砜 ( methioninesulfoximine,MSX)筛选出阳性细胞克隆 .利用 RT-PCR检测 rh HGF m RNA的表达 ,通过 ELISA法测定rh HGF的蛋白表达 ,3H掺入法检测培养上清液对大鼠原代培养肝细胞 DNA合成的影响 .结果表明转染p EE1 4 /rh HGF的细胞可扩增出 h HGF特异的 396bp RT-PCR片段 ,培养上清液明显促进大鼠肝细胞 DNA的合成 ,ELISA法测出上清液中 rh HGF的含量在 8μg/L以上 ,显示 rh HGF在

重组人肝细胞生长因子β链体外生物学活性的测定

目的 建立一种稳定灵敏的方法用于检测重组人肝细胞生长因子β链 (rhHGF β)对原代培养成年大鼠肝细胞的增生作用。方法 利用噻唑蓝 (MTT)比色方法在多种实验条件下对rhHGF β进行生物学活性检测。结果 对于体外原代培养成年大鼠肝细胞 ,rhHGF β可刺激肝细胞的增生 ,且有剂量依赖效应。 结论 确定了原代培养肝细胞检测rhHGF

重组人肝细胞生长因子α高效表达工程菌筛选及发酵工艺研究

将人肝细胞生长因子α重组质粒转化至不同E.coli菌株,在相同培养条件下比较其表达量,筛选高表达工程菌株;在15L的发酵罐内,采用分批补料培养的方法,研究表达菌株的发酵培养条件,检测改变发酵培养基成分、种子液接种量、诱导时间等参数对菌液密度以及蛋白表达的影响,同时检测质粒传代的稳定性。实验结果表明筛选出的高表达工程菌在优化的发酵培养条件下,菌体收获量可达52g/L,目的蛋白表达量约占菌体可溶性总蛋白的25%,且质粒和蛋白表达均具有良好的稳定性。高效表达工程菌和优化发酵工艺可以较好地提高菌体收率,为规模化生产奠定了基础。

重组人肝细胞生长因子在人脐带间质干细胞中高效表达

目的:构建能表达人肝细胞生长因子(hHGF)的pWPI-hHGF载体,并将含hHGF基因的重组慢病毒载体转染人脐带间质干细胞(hUCMSCs),观察人脐带间质干细胞中hHGF的表达情况。方法:将携带目的基因hHGF的pUC-SRα/hHGF质粒亚克隆到真核细胞表达载体pWPI载体上,构建重组质粒pWPI-hHGF。基因测序进行HGF的鉴定。用磷酸钙沉淀法,将pWPI-hHGF、pAX2、pMD2G共同转染包装细胞293T细胞,获得携带目的基因hHGF和GFP基因的重组慢病毒pWPI-hHGF。将pWPI-hHGF及阳性对照质粒pWPI-GFP分别用Lipo-fectamin 2000介导转染体外培养的hUCMSCs。在荧光显微镜下计数,确定阳性对照质粒的转染数,从而估计该基因的转染效率。蛋白印迹法检测HGF和GFP蛋白的表达,ELISA法检测细胞上清液hHGF含量。结果:DNA测序显示hHGF基因成功地插入到pWPI载体中。包装细胞293T转导pWPI-HGF质粒后,转染阳性率达100%。阳性对照质粒转染人脐带间质干细胞24 h后,在荧光显微镜下观察,其转染效率达80%以上。蛋白印迹法检测靶细胞中hHGF表达呈强阳性,而对照组表达量极低,两者差异显著(P<0.01)。检测收集转染hHGF后的人间质干细胞上清液中hHGF的表达含量明显高于对照组(P<0.01)。结论:构建的在真核细胞内表达hHGF的重组质粒pWPI-hHGF转染人脐带间质干细胞,能获得hHGF基因在人脐带间质干细胞中大量、稳定的表达。

重组人肝细胞生长因子α在大肠杆菌中的表达及活性检测

目的 建立人肝细胞生长因子α链 (rhHGFα)高效原核表达体系。方法 以pRC/CMV hHGF为模板 ,扩增hHGFαcDNA ,继以XhoI酶切为 386和 95 4bp 2个片段 ,亚克隆入pBSKS,DNA测序后 ,将上述两个片段与pBV2 2 0连接 ,构建重组质粒。转化E .coliJM10 9、DH5α和BL2 1(DE3) ,筛选高效表达菌株。分离包涵体 ,8mol/L尿素溶解 ,梯度复性后利用反相和凝胶过滤层析纯化重组蛋白 ,经MTT法检测活性。结果 所克隆的hHGFα基因序列正确 ,筛选出高效表达菌株BY ,经SDS-PAGE显示在相对分子质量 5 2 0 0 0处出现特异的目的蛋白表达带 ,表达量约占全菌蛋白的 2 5 %。表达产物以不溶性的包涵体 (IBs)形式存在 ,复性后具有刺激原代大鼠肝细胞生长的作用。结论 已成功表达了rhHGFα蛋白 ,为研究rhHGFα结构与功能及中试生产奠定了基础。

重组人肝细胞生长因子重链(rhHGF-α)蛋白的表达与纯化

大肠杆菌中表达的rhHGF α以包涵体形式存在 ,表达量约占菌体总蛋白的 2 5 %。为了建立一条简便的分离纯化生产工艺 ,我们研究了包涵体溶解及复性条件 ,并进行了活性测定。结果表明 ,用含有 4mol/L尿素的缓冲液洗涤包涵体 ,8mol/L尿素溶解包涵体后的上清 ,经过SephacrylS 2 0 0凝胶过滤、复性后 ,得到纯度达 90 %的rhHGF α ,SDS PAGE测定相对分子质量为 5 2 0 0 0。与rhHGF β体外共复性后 ,完整的rhHGF具有明显刺激原代培养大鼠肝细胞生长的活性。

重组人肝细胞生长因子激活因子质粒的构建、表达和功能研究

背景：肝细胞生长因子激活因子（HGFA）是活化单链前体HGF（pro—HGF）成为有生物学功能的HGF的关键酶．在受损组织器官的修复和再生中发挥重要作用。目的：制备rhHGFA—Fc融合蛋白并证实其具有肝细胞保护功能。方法：采用基因重组技术构建表达人源化HGFA成熟肽段与人IgGFc段融合蛋白的载体，以脂质体介导法转染人胚肾293细胞。纯化293细胞表达产物，以蛋白质印迹法鉴定纯化蛋白（rhHGFA—Fc融合蛋白）及其对pr0．HGF的酶切活性，以流式细胞术检测融合蛋白介导的肝细胞凋亡抑制作用。结果：SDS—PAGE显示转染重组质粒的293细胞总蛋白纯化产物在62kDa处显示单一蛋白条带。蛋白质印迹法结果显示纯化的rhHGFA-Fc融合蛋白能与抗hHGFA单克隆抗体发生特异性反应，并将pro-HGF酶切为仅链和p链，酶切活性呈剂量依赖性，半效酶切活性（IC50）为8．22nmol／L；流式细胞术结果显示融合蛋白通过激活pro．HGF发挥其抑制肝细胞凋亡的作用。结论：293细胞表达的rhHGFA—Fc融合蛋白纯度高、酶切活性强，可高效激活pro—HGF，对于肝组织严重损伤，特别是肝硬化基础上肝损伤的治疗具有潜在价值。

重组人肝细胞生长因子β链工程菌的高密度发酵

目的 实现重组人肝细胞生长因子 β链 (rhHGFβ)工程菌的高密度高表达发酵。 方法 首先在摇瓶中进行了培养条件的摸索 ,确定了该工程菌的培养条件、诱导起始时间和诱导时间 ,然后用 15L自控发酵罐进行分批补料培养 ,发酵中分阶段限制性流加氮、碳源 ,保持溶氧在 30 %以上。结果 菌体发酵密度达到 39g/L(湿菌重 ) ,达到并超过了重组蛋白在摇瓶中的表达水平 ,重组蛋白的表达占菌体总蛋白的 30 %左右。结论 本研究为rhHGFβ进一步下游纯化及功能研究奠定了基础。

重组人肝细胞生长因子对心脏移植冠状血管内膜iNOS表达的影响及意义

目的:探讨重组人肝细胞生长因子(rh-HGF)对大鼠心脏移植冠状血管内膜诱生型一氧化氮合酶(iNOS)表达的影响及意义。方法:近交系健康雄性Wistar大鼠和SD大鼠,建立腹腔异位心脏移植模型。实验分3组:同系移植组,异系移植包括对照组(CsA组)和实验组(HGF组)。分别于术后15d、60d采集各组标本,沿冠状动脉切取心肌组织,免疫组化检测冠状血管内膜iNOS的表达,RT-PCR检测冠状血管内膜iNOSmRNA表达,观测冠状血管病理变化。结果:实验组移植心脏冠状动脉内皮细胞完整,内膜轻度增厚,管腔轻度狭窄,病理改变明显轻于对照组。iNOS在移植心脏冠状动脉内膜的表达,实验组均明显高于对照组及同系移植组(P<0.01)。结论:rh-HGF通过上调移植心脏冠状血管内膜iNOS表达,可保护冠状血管内皮功能,预防移植心脏血管病的发生。

重组人肝细胞生长因子对心脏移植后冠状动脉内膜c-Met表达的影响

目的探讨重组人肝细胞生长因子(rh-HGF)对大鼠移植心脏冠状动脉内膜c-Met表达的影响及其意义。方法雄性Wistar大鼠80只,雄性SD大鼠40只,建立腹腔异位心脏移植模型。将60只受体大鼠分为3组,对照组:20只Wistar大鼠,术后当天开始腹腔注射生理盐水1ml/kg.d;环孢菌素A(CsA)组:20只SD大鼠,术后当天开始腹腔注射CsA5mg/kg.d;rh-HGF组:20只SD大鼠,术后当天开始腹腔注射rh-HGF500μg/kg.d+CsA5mg/kg.d。分别于术后15d、60d观察冠状动脉的病理变化;采用免疫组织化学方法检测冠状动脉内膜c-Met的表达,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测冠状动脉内膜c-MetmRNA的表达。结果rh-HGF组移植心脏冠状动脉内皮细胞完整,内膜轻度增厚,管腔轻度狭窄,病理改变明显轻于CsA组。术后15d、60drh-HGF组c-Met和c-MetmRNA在移植心脏冠状动脉内膜的表达均明显高于CsA组和对照组(术后60dc-Met:1.85±0.26vs.0.96±0.10,t=8.491,P=0.000;1.85±0.26vs.0.58±0.03,t=13.725,P=0.000;术后60dc-MetmRNA:1.92±0.22vs.0.88±0.07,t=11.940,P=0.000;1.92±0.22vs.0.42±0.02,t=19.206,P=0.000)。结论rh-HGF通过上调移植心脏冠状动脉内膜c-Met的表达,可促进冠状动脉内皮细胞修复和再生,预防移植心脏血管病的发生。

重组人肝细胞生长因子重链在大肠杆菌中的表达研究

目的 观察经过转录前加工、修饰后克隆至表达载体pBV2 2 0中的人肝细胞生长因子α链cDNA在大肠杆菌的表达情况 ,优化表达条件 ,以建立hHGFα原核高效表达体系 ,并进一步研究hHGF -α蛋白的生物学功能。方法与结果 将重组表达质粒pBV2 2 0 hHGF α转化大肠杆菌DH5α、Plyss ,通过升温诱导法 ,即将温度由 30℃升高到 42℃ ,诱导外源基因表达。SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测hHGF α蛋白表达 ,电泳图谱显示一特异的分子量与单体hHGF α链吻合的蛋白带。SDS PAGE光密度扫描对外源基因表达产物进行初步定量 ,表达产物分别占细菌可溶性蛋白总量的 2 5 %、30 %。进一步行West ern blot对表达产物进行定性 ,外源基因表达蛋白与特异的hHGF α抗体呈阳性反应。结论 成功地建立了hHGF

重组人肝细胞生长因子真核表达载体的构建

目的构建重组人肝细胞生长因子(rhHGF)的真核表达载体,为后续毕赤酵母蛋白高效表达提供基础。方法根据酵母表达偏爱密码子合成rhHGFcDNA全长序列,将rhHGF和pGAPZαA质粒双酶切后行连接转化,构建穿梭载体pGAPZαA-rhHGF,并鉴定。结果重组真核表达载体pGAPZA-rhHGF经限制性内切酶分析,与理论值相符,测序结果未见碱基变异。结论成功构建了pGAPZαA-rhHGF真核表达载体,为后续毕赤酵母高效表达rhHGF蛋白提供了可行性。

重组人肝细胞生长因子基因的克隆

用RT PCR技术从人胎盘组织内成功地扩增全长肝细胞生长因子 (HGF)cDNA基因 (2 184bp) ,并将其克隆至pGEM T载体 ,经限制性核酸内切酶NdeⅠ ,Bg1Ⅱ ,HindⅢ ,BamHⅠ和XhoⅠ的酶谱分析和DNA测序分析证实。再将其亚克隆至逆病毒载体pLNL XHC 。

重组牛碱性成纤维细胞生长因子凝胶联合蒙脱石散对婴幼儿尿布疹的疗效观察与研究

目的探究重组牛碱性成纤维细胞生长因子(rbFGF)凝胶联合蒙脱石散对婴幼儿尿布疹的临床效果。方法选取2019年12月至2020年6月赣南医学院第一附属医院收治的72例婴幼儿尿布疹患儿作为研究对象,按照随机数字表法分为对照组与实验组,每组36例。对照组给予rbFGF凝胶干预,实验组在对照组基础上联合蒙脱石散干预,比较两组干预效果、恢复情况、皮肤损伤程度、血清学指标及不良反应发生情况。结果实验组治疗总有效率为94.44%,高于对照组的72.22%,差异有统计学意义(P<0.05)。干预后,两组皮肤发红、皮肤破裂面积及皮肤侵蚀程度评分均低于干预前,且实验组低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。实验组不良反应发生率为5.56%,低于对照组的25.00%差异有统计学意义(P<0.05)。实验组尿布疹消退时间、住院时间均短于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。干预后,两组肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-10(IL-10)水平均低于干预前,干扰素-γ(IFN-γ)水平高于干预前,且实验组TNF-α、IL-4、IL-10水平低于对照组,IFN-γ水平高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论rbFGF凝胶联合蒙脱石散应用于婴幼儿尿布疹的疗效显著,可减轻皮肤损伤程度,改善机体炎症反应,缩短尿布疹消退时间,且不良反应少,值得临床推广应用。

罂粟碱注射液联合重组牛碱性成纤维细胞生长因子治疗深度烧伤残余创面的临床研究

目的观察罂粟碱注射液联合重组牛碱性成纤维细胞生长因子(rb-bFGF)治疗深度烧伤残余创面的临床疗效。方法回顾性选取2019年1月至2023年6月入中国人民解放军联勤保障部队第九一〇医院治疗的深度烧伤患者80例作为研究对象,参考用药不同分为联合用药组(n=40)与单独用药组(n=40)。联合用药组采用rb-bFGF与罂粟碱注射液联合治疗,于5 cm×5 cm无菌纱布上涂抹300 IU/cm^(2)rb-bFGF之后将其于创面上覆盖,每日换药1次,肌肉注射罂粟碱注射液每日30 mg,每日2次。单独用药组单用rb-bFGF,用法同联合用药组。两组均持续治疗14 d。比较两组患者的治疗前及治疗后14 d的血清炎症因子[肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-10、IL-6、IL-4、IL-1β]水平,治疗后3、7、10、14 d的创面分泌物评分和创缘反应评分,创面愈合时间,总有效率及不良反应发生率。结果联合用药组患者治疗后14 d的血清TNF-α、IL-6、L-1β水平分别为(65.27±8.77)、(105.21±9.14)、(20.21±1.18)μg/L,均明显低于单独用药组[(89.26±9.32)、(128.32±8.21)、(29.36±1.28)μg/L],IL-10、IL-4水平分别为(537.75±22.92)、(162.42±17.79)μg/L,均明显高于单独用药组[(497.41±22.63)、(137.27±17.41)μg/L],差异均有统计学意义(P<0.05)。联合用药组患者治疗后3、7、10、14 d创面分泌物评分分别为(1.64±0.25)、(0.97±0.24)、(0.78±0.20)、(0.38±0.11)分,均低于单独用药组[(1.82±0.29)、(1.28±0.26)、(1.04±0.24)、(0.65±0.14)分],差异均有统计学意义(P<0.05)。联合用药组患者治疗后3、7、10、14 d创缘反应评分分别为(0.82±0.13)、(0.39±0.09)、(0.20±0.04)、(0.04±0.02)分,均低于单独用药组[(1.19±0.21)、(0.68±0.11)、(0.49±0.10)、(0.21±0.04)分],差异均有统计学意义(P<0.05)。联合用药组患者治疗后创面愈合时间为(22.84±3.02)d,明显短于单独用药组[(27.94±3.14)d],差异有统计学意义(P<0.05)。联合用药组患者的治疗后总有效率为97.50%,明显高于单独用药组(80.00%),差异有统计学意义(P<0.05)。两组均未发生皮肤刺痛及红痒等不良反应。结论深度烧伤残余创面治疗中,与单用rb-bFGF治疗相比,罂粟碱注射液联合rb-bFGF的临床疗效明显提高,可进一步减轻炎症反应,加速创面愈合,且无明显不良反应。

重组牛碱性成纤维细胞生长因子凝胶联合调Q激光治疗面部脂溢性角化病

目的:探讨重组牛碱性成纤维细胞生长因子(Recombinant bovine basic fibroblast grow,rb-bFGF)凝胶联合调Q激光治疗面部脂溢性角化病(Seborrheic keratosis,SK)的效果。方法:选笔者医院2020年6月-2023年6月收治的82例面部SK患者为研究对象。按随机数字表法分为对照组(n=41)与观察组(n=41),两组均进行调Q激光治疗(波长532 nm),观察组在对照组基础上给予rb-bFGF凝胶治疗。观察对比两组疗效、疼痛程度、痂皮完全脱落时间、遗留红斑持续时间、皮肤病生活质量量表(Dermatology life quality index,DLQI)及不良反应发生情况。结果:观察组有效率较对照组高,差异有统计学意义(P<0.05);观察组疼痛视觉模拟评分法(Visual analogue scale,VAS)评分较对照组低,创面痂皮完全脱落时间、遗留红斑持续时间均较对照组短,差异均有统计学意义(P<0.05)。治疗后,两组DLQI除治疗维度外其他维度评分均较治疗前降低(P<0.05),且观察组均低于对照组(P<0.05);观察组不良反应发生率为0.93%,对照组为6.03%,差异无统计学意义(P>0.05)。结论:rb-bFGF凝胶联合调Q激光治疗面部SK疗效显著,可促进创面恢复,减轻恢复期疼痛,提高患者生活质量。

血清可溶性CD40L与肝细胞生长因子联合检测在急性肺栓塞患者诊断中的应用价值

目的探讨血清可溶性CD40L(sCD40L)、肝细胞生长因子(HGF)联合检测在急性肺栓塞患者诊断中的应用价值。方法选取2021年1月至2022年12月延安市人民医院收治的96例急性肺栓塞患者为肺栓塞组,根据《肺血栓栓塞症的诊断与治疗指南(草案)》相关标准分为大面积肺栓塞组(50例)及非大面积肺栓塞组(46例)。另选取同期于延安市人民医院就诊的90例非急性肺栓塞患者为对照组;收集两组临床资料及空腹血液,采用酶联免疫吸附法检测两组血清中sCD40L、HGF水平;采用Pearson法分析血清sCD40L与HGF水平的相关性;采用受试者工作特征曲线(ROC)分析血清sCD40L、HGF水平对急性肺栓塞的诊断价值。结果肺栓塞组血清sCD40L、HGF水平明显高于对照组(P<0.05);大面积肺栓塞组血清sCD40L、HGF水平明显高于非大面积肺栓塞组(P<0.05)。肺栓塞组患者血清sCD40L与HGF水平呈正相关(r=0.613,P<0.05)。ROC曲线显示,血清sCD40L、HGF诊断急性肺栓塞的曲线下面积(AUC)分别为0.820、0.848,特异度分别为82.2%、82.2%,敏感度分别为72.9%、72.9%,最佳截断值分别为113.48、492.81 ng/L;sCD40L和HGF联合诊断急性肺栓塞的AUC为0.875,特异度为91.1%,敏感度为74.1%。结论急性肺栓塞患者血清sCD40L、HGF水平升高,且二者呈正相关,sCD40L与HGF联合检测可有效提高急性肺栓塞患者的诊断效能。