重组人肽抗生素hPAB-β的初步纯化

目的 探索重组人肽抗生素hPAB β的纯化工艺 ,为制备高纯度、高活性的重组hPAB β奠定基础。方法 将构建的含pQE32 CP hPAB β重组质粒的基因工程菌扩大培养 ,诱导表达后所得菌体经溶菌酶法裂解 ,鉴定融合蛋白表达形式 ;以含融合蛋白的溶液作为纯化的初始样品 ,采用Ni NTAresin亲和层析柱对融合蛋白进行纯化 ,用CNBr裂解 ,利用SephadexG 5 0、Bio gelP6DG凝胶进行分子筛层析 ,利用Macro PrepHighS进行阳离子交换层析 ,对层析峰行Tris Tricine电泳分析。结果 融合蛋白以包涵体形式存在 ;亲和层析获得了纯度为 82 .6 %的融合蛋白 ,CNBr作用 2 0h可完成融合蛋白的裂解 ;目的肽经纯化后 ,纯度达 95 %以上。结论 已初步建立了重组人肽抗生素hPAB β的纯化工艺 ,并获得了高纯度的肽抗生素hPAB β。

重组毕赤酵母高密度发酵表达肽抗生素hPAB-β及其抑菌活性初步鉴定

目的探讨hPAB-β工程菌的高密度发酵方法,鉴定发酵产物中目的肽的活性。方法采用补料分批培养方法,在3.7 L发酵罐中对重组酵母菌进行高密度发酵,温度控制在30℃,pH值范围为4.95～5.05,在菌体湿重达到200～250 g/L后开始诱导,经过约50 h甲醇诱导后结束发酵。对发酵上清进行反相层析、分子筛层析以及反相高效液相色谱纯化,通过抑菌实验对纯化产物进行活性鉴定。结果3次高密度发酵在菌体湿重分别达到235.0 g/L、210 g/L和264.8g/L时进行诱导表达,发酵上清中目标肽的表达量分别达73.7 mg/L、76.6 mg/L和74.3 mg/L。发酵上清通过反相层析、分子筛层析以及反相高效液相色谱纯化,获得重组肽抗生素hPAB-β,该重组蛋白经抑菌实验显示了较好的抑菌活性。结论成功实现了酵母工程菌的高密度发酵,为下一步规模化制备hPAB-β奠定了基础。

一个承载分子的设计与肽抗生素hPAB-β的高效表达

目的 通过设计一个承载蛋白分子高效表达肽抗生素hPAB β ,为大量制备hPAB β奠定基础。 方法 根据肽抗生素的特性 ,确立 4条设计原则 ,并据此设计一 489bp的承载蛋白编码序列 ,用化学合成法获得该序列并将之克隆到pQE 3 2中构建成表达载体 ,进一步将肽抗生素hPAB β基因插入上述表达载体 ,肽抗生素基因位于承载蛋白编码序列 3’ 端 ,两者构成融合基因。将含融合基因的表达载体转化大肠杆菌JM10 9,筛选阳性重组子 ,并用阳性重组子表达融合蛋白。结果 设计的承载蛋白为 163个氨基酸 ,分子量 17668.80 ,等电点 5 .62 1。用承载分子与肽抗生素hPAB β构建的融合蛋白表达载体转化细菌后 ,筛选到 4个阳性重组子 ,均能高效表达肽抗生素融合蛋白 ,融合蛋白的产量占细菌总蛋白的 40 %～ 45 %。结论 设计的承载蛋白分子能够实现肽抗生素的高效表达。

肽抗生素hPAB-β在毕赤酵母中的表达与活性鉴定

目的构建表达人源肽抗生素hPAB-β的重组毕赤酵母,为大量制备hPAB-β奠定基础。方法用PCR及引物延伸法得到天然及优化的hPAB-β序列,克隆入pPIC9K质粒,转化DH5α大肠埃希菌,用酶切和核苷酸测序鉴定。重组质粒经SalⅠ酶线性化,整合入毕赤酵母GS115中,在DNA,mRNA及蛋白水平鉴定阳性重组子。结果构建的含天然及优化序列的重组质粒酶切均可得到相应大小的插入片段,与预期相符,测序结果表明序列和阅读框均正确。线性化的重组质粒转入GS115后,得到7个不同的高拷贝阳性转化子,均能表达重组肽并具有良好的抑菌活性。结论本研究成功构建含天然及优化hPAB-β序列的重组毕赤酵母工程菌,能够用于肽抗生素hPAB-β的制备。

人肽抗生素hPABβ重组质粒的构建及其在大肠杆菌中的表达

目的 构建人肽抗生素hPAB β重组质粒 ,并在大肠杆菌中进行表达 ,为大量制备hPAB β奠定基础。方法 通过PCR将hPAB β融合蛋白的CNBr裂解位点改为羟胺裂解 ,将修改的目标片段克隆到pFAST HTa质粒中 ,挑取阳性重组子 ,酶切出目标片段再亚克隆到pQE32 CP中 ,含阳性重组子的工程菌用IPTG诱导表达 ,SDS PAGE电泳分析 ,进一步以亲和层析纯化融合蛋白 ,用羟胺裂解分析。结果 构建的pFAST hPAB β重组质粒经酶切可得到约 2 30bp的片段 ,与预期大小相符 ,测序结果表明其序列正确 ;构建的pQE32 CP hPAB β重组表达质粒酶切亦可切出 2 30bp的片段 ,测序结果表明序列和阅读框均正确 ;重组表达质粒在大肠杆菌中能表达出Mr约2 7× 10 3 大小的蛋白 ,表达量约占细菌总蛋白的 4 3% ,该融合蛋白以包涵体形式存在 ,通过亲和层析可获得该蛋白 ,纯度为 80 4 % ,该融合蛋白经羟胺裂解 1h即可得到与合成肽大小相符的小肽。结论 本研究成功构建了含hPAB β重组质粒的工程菌 ,为进一步研究和大量制备hPAB β创造了前提。

毕赤酵母表达肽抗生素hPAB-β的纯化

目的在成功构建肽抗生素hPAB-β重组毕赤酵母的基础上,深入探讨酵母表达hPAB-β的规模化纯化方法。方法采用高密度发酵法在3.7L发酵罐中对pPIC9K-hPAB-β/GS115优5重组菌株进行发酵,收集发酵液,依次采用W-UF-Ⅱ过滤系统超滤、反相层析、阳离子交换、分子筛层析等纯化技术对目标表达产物逐级进行纯化,目的蛋白用15%的Tricine-SDS-PAGE电泳进行跟踪分析。最终纯化产物的生物学活性用平板琼脂扩散法进行测定。结果在培养至工程菌菌体湿重约200～250g/L时,以甲醇诱导培养基诱导目的蛋白表达,48h后菌体湿重达280g/L,目标产物表达量约75mg/L。发酵液经Mr10000膜超滤,达到去除大部分酵母色素和浓缩样品的目的(体积浓缩约2/3)。再经反相层析、离子交换、分子筛层析纯化,最终目的产物的纯度达98%以上,得率达32.5%。且纯化的目的蛋白具有良好的杀灭金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的活性。结论酵母表达肽抗生素hPAB-β经膜超滤、反相层析、离子交换和分子筛层析四步纯化,实现了去除非目的蛋白、酵母色素及脱盐的目的,为规模化制备hPAB-β创造了前提。

肽抗生素hPAB-β的化学合成及其杀菌活性的初步证实

目的 化学合成、纯化并初步测定肽抗生素hPAB β的活性 ,为后续研究奠定基础。 方法 采用固相合成法合成肽抗生素hPAB β ,经RP HPLC纯化 ,用质谱进行分子量鉴定 ,谷胱甘肽氧化 还原法复性合成产物 ,进一步用阳离子交换柱纯化复性产物 ,收集主峰 ,药敏法初步测定合成肽的抗菌活性。结果 合成肽抗生素hPAB β的纯度为 86 5 2 % ,经质谱分析 ,合成肽的分子量测定值与理论值相符。用谷胱甘肽氧化 还原法复性合成肽取得了较好的效果。复性产物对大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌具有杀灭作用。结论 化学合成的肽抗生素hPAB β具有良好的杀菌活性。

人源肽抗生素hPABβ突变体及其重组杆状病毒的构建

确定人工合成的人肽抗生素hPAB β的抗菌活性。利用已知肽抗生素hBD 2的晶体结构坐标进行hPAB β的同源模建 ;设计hPAB β突变体 ;用PCR法生成hPAB β突变体基因 ,分别构建转移载体和重组杆状病毒。结果表明 ,合成肽hPAB β在正确复性后具有较好的杀菌活性 ,将 4种突变体基因插入转移载体pFASTHTa ,筛选阳性重组子pFAST hPAB β并转化DH10Bac大肠杆菌 ,获得了重组杆状病毒 ,为筛选活性强而结构更为简单的hPAB

人肽抗生素hPAB-β多拷贝串联基因工程菌的筛选及发酵研究

目的 :对已构建的人肽抗生素hPAB β 1～ 8拷贝串联基因工程菌进行筛选 ,并对其优势菌株进行发酵研究 ,为hPAB β的规模生产奠定基础。 方法 :对 1～ 8拷贝串联基因工程菌的目标蛋白表达率进行比较后 ,选择 2～ 5拷贝菌进行菌产量、目标蛋白表达率、包涵体溶解性、亲和层析效果比较 ,确定最佳多拷贝菌 ;对其摇瓶条件下发酵的培养液、温度、气体条件、IPTG诱导时机、浓度及时间进行研究。 结果 :在相同条件下 ,3拷贝菌产量(3.15 3g/L)最高 ,目标蛋白表达率 (2 7.8% )接近最高水平 ,包涵体能溶解完全 ;利用亲和层析能成功捕获融合蛋白 ,后者经羟胺裂解 ,可获得相对分子质量与合成hPAB β成熟肽大小相符的小肽 ,筛选出的优势菌传代稳定 ,其最佳摇瓶发酵条件为 37℃ ,16 0r/min条件下 ,在改良M 9 CAA培养液中培养至吸光值 (A60 0 )≈ 2 .5时 ,以终浓度为10 0 μmol/L的IPTG诱导表达 5h。 结论 :确定了 3拷贝菌为最佳多拷贝菌 ,并确定了其最佳摇瓶发酵参数。

降钙素原指导下早期使用抗生素联合重组人脑利钠肽治疗心力衰竭临床疗效观察

目的观察降钙素原(PCT)指导下,早期抗生素联合重组人脑利钠肽治疗心力衰竭的临床疗效。方法将心力衰竭患者(心功能Ⅲ级与Ⅳ级)180例随机双盲分为对照组和治疗组各90例。所有患者降钙素原水平在0.05～0.2 ng/mL范围内,已大于正常高限值。对照组:重组人脑利钠肽+常规抗心衰治疗;治疗组:早期抗生素+重组人脑利钠肽+常规抗心衰治疗。检测所有入组患者入院时、治疗48 h、治疗96 h,血清降钙素原(PCT)含量、血清C反应蛋白(CRP)含量、左心室脏射血分数、脑钠肽前体NTpro-BNP1、氧和指数、血清光抑素-C。结果 (1)治疗96 h,与对照组比较,治疗组左心室射血分数显著升高(P <0.05);脑钠肽前体NTproBNP1显著降低(P <0.05);降钙素原水平显著降低(P> 0.05);C反应蛋白(CRP)与对照组比较(P <0.05)。(2)治疗96 h,与对照组比较,治疗组氧和指数显著升高(P <0.05);血清光抑素-C水平显著降低(P <0.05)。结论降钙素原(PCT)指导下,早期抗生素联合重组人脑钠肽治疗心力衰竭,临床疗效优于常规抗心衰治疗方案,患者可能更早获益。

重组鸭β-防御素-2制剂对小猪生长性能的影响

传统饲用抗生素在畜禽口粮中应用为畜牧业的快速发展起了重要的推动作用。但是，随着饲用抗生素的大量使用，饲用抗生素的耐药性与药残等负面影响也逐渐突出，寻找合适的活性物质来替代饲用抗生素已成为当前国内外研究的热点。防御素是生物机体特定基因编码产生的一类阳离子抗菌活性多肽，不仅对细菌、真菌、病毒、支原体、衣原体、螺旋体具有杀伤活性，同时还在免疫调节等方面起着重要作用（Lynnetal，2007；Lehrer et al,1999）。

家蝇基因组文库的构建

从孵化 36 h的蝇蛆中提取基因组 DNA,用限制性内切酶 Bcl 随机酶切 ,回收 10～ 2 3kb的酶切 DNA片段 ,通过匹配粘性末端与磷酸化的 EMBL3Bam H 酶切载体臂连接 ,在体外经包装系统包装成活的重组噬菌体 ,成功地构建了家蝇基因组文库。重组噬菌体转染 KW2 51 宿主菌 ,测定文库效价为 5× 10 4 pfu/m

硫链丝菌素可提高变青链霉菌对阿霉素的耐受性

硫链丝菌素(Thiostrepton,Thio)是一种分离自S.azureus的多肽类抗生素,分子量1650。因为绝大多数放线菌对Thio均非常敏感,所以链霉自遗传工程所构建的重组载体多含有Thio耐受基因(tsr)作为筛选标志。我们在利用p^1J922作为重组载体,变青链霉菌作为宿主克隆阿霉素生物合成基因的研究中首先发现,变青链霉菌和转化有质粒的变青链霉菌孢子对阿霉素的耐受性分别为5ug/ml和10ug/ml。在存在Thio的情况下,上述菌株对阿霉素的耐受性提高一倍。产生这一现象的原因尚不清楚。利用阿霉素产生菌DNA在体外与Thio和阿霉素反应后进行琼脂糖电泳发现:Thio自身对DNA电泳模式无任何影响,但它可明显抑制阿霉素在体外对DNA的嵌合效应。

美国明尼苏达大学用抗乳酸链球菌素基因开发食品用乳酸菌载体

美国明尼苏达大学教授Larry L.Mckay分离乳链球菌(Streptococcus lactis)所产生的抗菌多肽,抗乳酸链球菌素的基因,并制作重组载体成功。正在研讨作为食品用的基因重组质粒载体使用的菌。

天蚕素B-黄体生成素释放激素结合部位重组基因的构建及其抑癌功能的研究

目的构建天蚕素 B-黄体生成素释放激素结合部位(CB-LHRH')重组基因,探讨 CB-LHRH'蛋白成为新型抗肿瘤靶向药物的可能性。方法设计并人工合成 CB-LHRH′重组基因序列,应用昆虫细胞-杆状病毒表达系统表达目的蛋白并通过蛋白斑点印迹法鉴定,采用二甲氧唑黄(XTT)比色法检测不同剂量的目的蛋白对卵巢上皮性癌细胞株 SKOV3(LHRH 受体阴性)和子宫内膜癌细胞株 HEC-1B(LHRH 受体阳性)细胞的生长抑制率,并进行镜下形态观察。结果蛋白斑点印迹法检测结果显示,重组杆状病毒感染的 Sf9细胞裂解液呈现棕色,证实 CB-LHRH'蛋白已表达。重组杆状病毒感染的昆虫细胞系 Sf9细胞裂解液对 SKOV3及 HEC-1B 细胞的生长抑制率,随作用时间的延长和剂量的增加而增加,SKOV3细胞的生长抑制率从(5.03±0.08)%增加至(53.24±1.22)%,HEC-1B细胞的生长抑制率从(5.13±0.37)%增加至(56.16±1.08)%。相同剂量的重组杆状病毒感染的 Sf9细胞裂解液,作用相同时间,其对 HEC-1B 细胞的生长抑制率高于 SKOV3细胞,差异有统计学意义(P<0.01)。经重组杆状病毒感染的 St9细胞裂解液作用后,镜下可见癌细胞出现明显改变甚至成片坏死崩解为无定形的颗粒状物质。结论 CB-LHRH'蛋白可有效杀伤 LHRH 受体阳性的HEC-1B 细胞,有望成为治疗表达 LHRH 受体的肿瘤的抗肿瘤靶向药物。