重组人胰岛素样生长因子Ⅰ对成骨细胞的影响

背景：人胰岛索样生长因子I在成骨细胞中含量丰富，与骨密度有密切关系。目的：观察重组人胰岛素样生长因子I对体外培养大鼠成骨细胞的增殖、凋亡及碱性磷酸酶合成的影响。方法：不同质量浓度重组人胰岛素样生长因子I刺激体外培养的大鼠成骨细胞，噻唑蓝法测定活细胞数量；肿瘤坏死因子a单独或与重组人胰岛素样生长因子I共同刺激成骨细胞，流式细胞仪检测细胞周期和凋亡率，采用对硝基酚磷酸盐法测定细胞裂解液中碱性磷酸酶活性。结果与结论：与对照组相比，一定剂量的重组人胰岛素样生长因子I能明显增加大鼠成骨细胞数量（P〈0．05），在质量浓度为0．1-100pg／L时，成骨细胞数量的增加与质量浓度呈正相关；肿瘤坏死因子a在0．1-100pg／L范围内呈剂量依赖性地促进成骨细胞凋亡（户〈0．05），并使S期细胞减少（尸〈0．05），而重组人胰岛素样生长因子I能抑制肿瘤坏死因子a对成骨细胞的促凋亡作用（P〈0．05）：与对照组相比，重组人胰岛素样生长因子I刺激的成骨细胞碱性磷酸酶的活性明显增高（尸〈0．05）。重组人胰岛素样生长因子I对大鼠成骨细胞有明显的促增殖作用，且能明显抑制肿瘤坏死因子a诱导的大鼠成骨细胞凋亡，提示增加成骨细胞数量可能是重组人胰岛索样生长因子I促进骨形成的机制之一：重组人胰岛素样生长因子I能促进大鼠成骨细胞碱性磷酸酶的合成，提示重组人胰岛素样生长因子I有可能促进骨基质的合成和钙化。

重组人胰岛素样生长因子-1纯化及其鉴定的研究

目的:利用亲和层析法将家蚕幼虫中高效表达的重组人胰岛素样生长因子(recombinanthumaninsulin鄄likegrowthfactor鄄1,rhIGF鄄1)纯化并鉴定,以得到具有免疫学活性和生物学活性的rhIGF鄄1生物制品。方法:蚕血淋巴中rhIGF鄄1初步提纯去除杂质,采用亲和层析法纯化rhIGF鄄1。以ELISA法测定纯化产物中rhIGF鄄1含量,用SDS鄄PAGE和Western鄄blot分析鉴定rhIGF鄄1纯度及免疫学活性,4-甲基偶氮唑蓝(tetrazoliumsalt,MTT)法观察其对MCF鄄7细胞增殖的影响。结果:纯化后rhIGF鄄1纯度约为40%,Westernblot分析发现,主要纯化产物相对分子质量为7.5ku的成熟hIGF鄄1,所含非目的产物与hIGF鄄1无免疫交叉反应。细胞活性刺激实验显示,rhIGF鄄1纯品对MCF鄄7细胞有较好的刺激活性,促增殖能力优于来源于大肠杆菌的rhIGF鄄1产品。结论:蚕血淋巴中的rhIGF鄄1经亲和层析后初步得到纯化,并显示良好的免疫学活性和生物学活性。

重组人胰岛素样生长因子I对大鼠成骨细胞增殖、凋亡及I型胶原蛋白合成的影响

目的 观察胰岛素样生长因子Ⅰ（IGF-Ⅰ）对体外培养的大鼠成骨细胞的增殖、凋亡及Ⅰ型胶原蛋白合成的影响，探讨IGF-Ⅰ对骨代谢影响的可能机制。方法 不同浓度rhIGF-Ⅰ刺激体外培养的大鼠成骨细胞，采用噻唑蓝（MTT）法测定细胞增殖能力；肿瘤坏死因子α（TNF-α单独或与rhIGF-Ⅰ共同刺激成骨细胞，流式细胞仪检测细胞周期和凋亡率；rhIGF-Ⅰ刺激成骨细胞，免疫细胞化学结合计算机图像分析系统检测Ⅰ型胶原蛋白的表达。结果 一定浓度IGF-Ⅰ能明显增加成骨细胞数量（P〈0．05），在0．1～100ng／ml这种作用与IGF-Ⅰ的浓度呈正相关；TNF-α在0．1～100ng/ml浓度范围内呈剂量依赖性地促进成骨细胞凋亡（P〈0．05），并使S期细胞减少（P〈0．05），而IGF-Ⅰ能抑制，TNF-α对成骨细胞的促凋亡作用（P〈0．05）；经IGF-Ⅰ的刺激，成骨细胞Ⅰ型胶原蛋白的表达明显高于对照组（P〈0．05）。结论 IGF-Ⅰ对大鼠成骨细胞有明显的促增殖作用，在0．1～100ng/ml之间呈浓度依赖性，IGF-Ⅰ能抑制，TNF-α诱导的大鼠成骨细胞凋亡，IGF-Ⅰ能促进大鼠成骨细胞Ⅰ型胶原蛋白的合成。

重组人胰岛素样生长因子I(rhIGF-I)对大鼠成骨细胞增殖和功能的影响

目的:观察胰岛素样生长因子I(IGF鄄I)对体外培养的大鼠成骨细胞的增殖、碱性磷酸酶(ALP)的合成和钙化结节形成的影响。方法:不同浓度IGF鄄I分别刺激培养的大鼠成骨细胞,采用噻唑蓝(MTT)法测定细胞增殖能力;采用对硝基酚磷酸盐法测定细胞裂解液中ALP活性;VonKossa染色测定钙化结节数目。结果:一定浓度IGF鄄I能明显增加大鼠成骨细胞数量(P<0.05),在0.1～100.0ng/ml这种作用与IGF鄄I的浓度呈正相关;经IGF鄄I刺激,大鼠成骨细胞ALP合成明显高于对照组(P<0.05);经IGF鄄I刺激,大鼠成骨细胞钙化结节数目明显高于对照组(P<0.001)。结论:IGF鄄I能增加体外培养的大鼠成骨细胞数量,促进成骨细胞ALP合成和钙化,提示IGF鄄I可能直接促进骨形成。

重组人胰岛素样生长因子-1分离纯化工艺的建立

目的 建立重组人胰岛素样生长因子 1(rhIGF 1)大肠杆菌表达后的高效分离纯化工艺 ,以便获得高纯度的重组蛋白。方法 已构建好的表达载体转化大肠杆菌BL2 1,经IPTG诱导进行表达。将离心收集到的菌体用超声破壁 ,破壁菌液离心分离 ,收集上清液 ,进行阴离子交换层析、疏水层析和分子筛纯化 ,得到最终纯品。蛋白纯度用SDS PAGE鉴定 ,ELISA法检测rhIGF 1含量 ,检测纯化后重组蛋白的生物学活性。结果 用大肠杆菌BL2 1表达rhIGF 1以可溶性形式存在胞浆中 ,经 3步柱层析纯化后 ,可获得高纯度的rhIGF 1(纯度 >98% )。该蛋白在体外具有良好的促NIH3 T3 细胞增殖作用。结论 建立了rhIGF 1分离纯化工艺 ,其工艺流程可获得具有生物学活性的高纯度rhIGF 1,为产业化及临床应用奠定基础。

重组人胰岛素样生长因子-1大肠杆菌高密度发酵研究

目的建立重组人胰岛素样生长因子-1(hIGF-1)在大肠杆菌高密度发酵中表达的工艺。方法以工程菌DH5α/pET32a(IGF-1)为对象,通过分批发酵培养优化溶解氧浓度、pH及温度等发酵条件,在此基础上以甘油为限制性基质进行分批补料发酵,考察不同补料方式对发酵的影响。结果适合重组hIGF-1在工程菌高密度发酵中表达的条件:在菌株活化与初始培养后,诱导时控制发酵系统溶解氧浓度为20%,温度为30℃,pH为7.2并以恒定pH反馈补料,发酵12h菌体密度OD600达44.53,得菌体干质量17.49g/L,平均生产强度为1.458g.L-1.h-1,其中重组hIGF-1的相对表达量为32.5%。结论研究为工业化生产hIGF-1奠定了基础。

重组人胰岛素样生长因子1对脑出血大鼠磷酸化丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶及凋亡细胞的作用

目的探讨重组人胰岛素样生长因子1(rhIGF-1)对大鼠脑出血血肿周围区磷酸化丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶(p-Akt)及凋亡细胞的影响。方法健康雄性Wistar大鼠78只,随机将其分为假手术组(6只)、脑出血对照组(简称对照组,36只)、rhIGF-1干预组(简称干预组,36只)。对照组和干预组大鼠按照给予干预措施后的6个时间点再随机分为6个亚组:6、12 h组和1、2、4、7 d组,每个亚组为6只大鼠。采用Ⅳ型胶原酶立体定位法制备大鼠急性脑出血模型。干预组经尾静脉注射rhIGF-1(50μg/kg),1次/d,直至实验结束。假手术组和对照组每天经尾静脉注射等量等渗盐水。各组在规定的时间取材,采用免疫组化方法观察血肿周围区p-Akt的表达;脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的dUTP缺口末端标记技术(TUNEL)法检测凋亡细胞。结果①对照组大鼠和干预组大鼠的神经功能缺损评分在术后1 d或2 d达到最高,此后逐渐降低,干预组大鼠的评分仅在术后第7天时低于对照组,差异均有统计学意义,P<0.05。②假手术组大鼠仅少量表达p-Akt阳性细胞。在6 h以外的其余各时间点,干预组大鼠的p-Akt阳性细胞数量均高于对照组,差异有统计学意义,P<0.05。③假手术组大鼠仅少量表达TUNEL阳性细胞。在除6 h外的其余各时间点,干预组大鼠的TUNEL阳性细胞数量均低于对照组,差异均有统计学意义,P<0.05。结论 rhIGF-1能减少脑出血后的细胞凋亡,改善神经功能缺损评分,其作用可能与p-Akt的激活有关。

重组人胰岛素样生长因子-1对坐骨神经损伤的修复作用

目的在大鼠坐骨神经钳夹损伤模型上,探讨重组人胰岛素样生长因子-1(hIGF-1)融合蛋白的治疗作用。方法 40只Wistar大鼠随机分为假手术组、模型组及hIGF-1融合蛋白高(0.02mg)、低(0.002mg)剂量处理组,建立大鼠坐骨神经钳夹损伤模型;以大鼠行为学、坐骨神经功能指数(SFI)、坐骨神经-腓肠肌诱发电位、组织形态学变化为指标,综合考察hIGF-1融合蛋白对损伤坐骨神经的影响。结果术后20~32d,各测定时间点hIGF-1融合蛋白高、低剂量组大鼠SFI值及SFI恢复率显著高于模型组(P<0.05),作用呈剂量依赖性。术后35d,hIGF-1融合蛋白高、低剂量组大鼠坐骨神经-腓肠肌诱发电位振幅显著高于模型组(P<0.01),作用随剂量增大而增强。H-E染色显示,hIGF-1融合蛋白高、低剂量组大鼠坐骨神经损伤区再生神经排列较模型组规则,有髓神经纤维增多,髓鞘较厚且完整。结论重组hIGF-1融合蛋白能促进大鼠坐骨神经损伤的修复。

重组人胰岛素样生长因子1的原核可溶性表达及活性鉴定

目的:原核可溶性表达人胰岛素样生长因子1(hIGF-1)并进行生物活性测定。方法:PCR扩增hIGF-1核酸序列,克隆至融合表达载体pET-DsbC中,转入大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导、表达和纯化,对融合蛋白DsbC-hIGF-1分别进行酶切、Western印迹和生物活性测定。结果:融合蛋白DsbC-hIGF-1在原核系统内经IPTG诱导,主要以可溶性形式表达,其表达量占菌体总蛋白量的30%～35%,Western印迹和MTT法测定结果证明重组DsbC-hIGF-1蛋白具有较强的抗原活性和明显的促NIH/3T3细胞增殖作用。结论:融合蛋白DsbC-hIGF在大肠杆菌中以可溶性表达形式存在并具有类似天然hIGF-1的生物活性,这对进一步研究hIGF-1的结构和功能,开发相应的基因工程产品具有重要意义。

重组人胰岛素样生长因子1的制备

目的:建立人胰岛素样生长因子1(IGF-1)基因大肠杆菌高效表达系统及rhIGF-1的初步纯化方法。方法:将人IGF-1基因克隆入原核表达质粒载体pBV220,重组质粒转化大肠杆菌DH5α,温度诱导表达,WesternBlot对表达产物进行鉴定。超滤离心纯化rhIGF-1,纯化产物行高效液相色谱分析。H3-TdR掺入法测定所制备rhIGF-1的促细胞增殖活性。结果:成功构建了重组质粒pBV-IGF-1,聚丙烯酰胺凝胶电泳可见与预期7.5ku大小相符的蛋白条带,WesternBlot证实该条带即为rhIGF-1。超滤离心一步纯化后rhIGF-1纯度即可达95%以上。H3-TdR结果显示,所制备的rhIGF-1可促进体外培养成肌细胞增殖。结论:成功建立了rhIGF-1的制备及纯化方法,表达产物经体外试验证实具有促细胞增殖的生物活性。

重组人胰岛素样生长因子-1对db/db小鼠应激性血糖升高的保护作用

目的:研究重组人胰岛素样生长因子(rhIGF)-1对2型糖尿病(T2DM)伴胰岛素抵抗(IR)小鼠应激性血糖升高的治疗作用。方法:以瘦素受体基因缺陷型db/db小鼠为动物模型,电脉冲刺激诱发应激性高血糖。给予高剂量胰岛素或rhIGF-1进行干预,观察血糖的变化情况。Real time-PCR及Western blot分别检测骨骼肌组织内GLUT4基因的表达水平及GLUT4蛋白含量。结果:在8周龄时瘦素受体基因缺陷的db/db小鼠表现出了明显的肥胖、高血糖及高胰岛素血症。应激后组间血糖水平的差异有统计学意义(F组间=48.915,P<0.05),组内不同时间点血糖水平差异无统计学意义(F时间=1.295,P>0.05),组间和时间无交互效应(F交互=1.046,P>0.05)。采取干预措施后,组间血糖水平差异有统计学意义(F组间=36.947,P<0.05),不同时间点血糖水平差异有统计学意义(F时间=13.880,P<0.05),且组间和时间存在交互效应(F交互=11.769,P<0.05)。IGF-1可显著增加db/db小鼠骨骼肌组织中GLUT4基因的表达及GLUT4蛋白在细胞膜中的含量。结论:rhIGF-1对T2DM小鼠被诱发的应激性高血糖具有较胰岛素更好的控制作用,此作用可能是因骨骼肌细胞中GLUT4的表达及转位增加所致。

重组人胰岛素样生长因子-Ⅰ对心肌梗死大鼠心肌基质金属蛋白酶表达及心肌间质降解的影响

目的:探讨重组人胰岛素样生长因子-Ι(rhIGF-Ι)对心肌梗死(MI)大鼠心肌基质金属蛋白酶(MMPs)的表达及心肌间质降解的影响。方法:48只SD大鼠腹腔注射异丙基肾上腺素建立MI模型后随机分成3组,每组16只,术后分别给予rhIGF-Ι50μg·kg-1·d-1(IGF-I组)、奥曲肽50μg·kg-1·d-1(Oct组)和生理盐水5mL·kg-1·d-1(MI组),每组按照用药时间(2、14d)再分成2个亚组(分别是IGF-I2d、IGF-I14d,Oct2d、Oct14d,和MI2d、MI14d组,n=8),另取8只正常SD大鼠作为阴性对照组。超声测定大鼠左室前壁(LVAW)、后壁(LVPW)厚度、左室收缩末期内径(LVESD)、左室舒张末内径(LVEDD)以及短轴缩短率(FS);大鼠处死后消化法测定心肌组织匀浆羟脯氨酸浓度;免疫组织化学法检测基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)及基质金属蛋白酶组织抑制因子-1(TIMP-1)在心肌中的表达。结果:与MI组相比,IGF-I组大鼠梗死区心肌MMP-2、MMP-9活性降低,TIMP-1表达增加,心肌胶原降解减少,LVEDD、LVESD减小,FS增加;Oct组MMP-2、MMP-9表达增加,胶原蛋白降解显著,LVAW降低,LVEDD、LVESD增加,FS下降。结论:rhIGF-Ι治疗使MI大鼠心肌MMPs活性减弱,TIMP-1表达上调,心肌间质胶原降解减少,心室重构减轻。

重组人胰岛素样生长因子-1工程菌发酵培养基的优化

在摇瓶条件下,以M9培养基为基础,采用单因素实验和正交实验,对适合于表达重组人胰岛素样生长因子-1工程菌生长的高密度发酵培养基进行了优化。确定最佳培养基配方为:葡萄糖0.4%、甘油1.5%、酵母粉3%、胰蛋白胨3%、Na2HPO41.2%、KH2PO40.6%、NH4Cl 0.1%、NaCl 0.20%、MgSO40.048%,在此优化培养基中培养14h,工程菌菌体密度OD600达7.5。

重组人胰岛素样生长因子1工程菌的高密度发酵(英文)

背景:胰岛素样生长因子1是人体内重要的细胞调控因子,已用于治疗糖尿病等多种疾病,工程菌发酵生产工艺研究是胰岛素样生长因子1实现产业化从而扩大临床应用的关键因素。目的:探讨表达重组人胰岛素样生长因子1工程菌的高密度发酵与表达条件。设计、时间及地点:酶基因工程实验,于2007-05/2008-05在浙江树人大学生物技术实验室完成。材料:重组人胰岛素样生长因子1大肠杆菌表达菌株E.coliBL21(DE3)/pET22a-IGF-1由浙江树人大学生物技术实验室保存。高密度发酵补料培养基为:葡萄糖300g/L,蛋白胨40g/L,酵母粉10g/L,Na2HPO4280mmol/L,NaH2PO4·2H2O120mmol/L,MgSO410mmol/L,氨苄青霉素100mg/L。方法:菌株活化后,进行摇瓶发酵试验,分别改变培养基种类、诱导剂异丙基硫代半乳糖苷浓度、诱导时间等参数,优化摇瓶发酵条件。依据摇瓶发酵优化条件,采用自控5L发酵罐进行分批补料发酵试验。培养分分批培养和分批补料2个阶段。采用pH反馈流加的方式补料,在对数生长中后期开始诱导,加入异丙基硫代半乳糖苷至设计终浓度,培养4～6h。主要观察指标:重组人胰岛素样生长因子1工程菌的发酵与产物表达情况。菌体浓度与菌体干重测定,目的蛋白表达量的测定,发酵液葡萄糖浓度的测定。结果:以2×YT+5g/L葡萄糖为发酵培养基,经0.8mmol/L异丙基硫代半乳糖苷诱导5h,通过控制溶解氧以及pH反馈补料方式,实现工程菌高密度发酵与目的蛋白高效表达,每升发酵液收获干菌体50.1g/L,重组人胰岛素样生长因子1含量达5.25g/L。结论:实验成功建立了重组人胰岛素样生长因子1工程菌优化的高密度发酵工艺,为重组人胰岛素样生长因子1的下游纯化和工业化生产奠定了基础。

重组人胰岛素样生长因子-1局部毒性、免疫原性研究

目的考察重组人胰岛素样生长因子-1(rhIGF-1)的局部毒性、免疫原性。方法家兔连续7d皮下注射rhIGF-1,末次给药后48h,对给药部位皮肤进行组织病理学检查;豚鼠隔日连续3次腹腔注射rhIGF-1致敏,末次致敏后14d静脉注射激发,激发后密切观察过敏反应症状;体外试管法观察rhIGF-1的溶血作用;小鼠每周皮下注射rhIGF-1 2次,连续4周,间接ELISA法检测抗体产生情况。结果皮下刺激性试验提示,rhIGF-1对皮下组织有刺激作用;全身主动过敏反应中阴性对照组过敏反应呈阴性,低剂量组、高剂量组和阳性对照组过敏反应呈极强阳性;体外溶血试验不引起溶血反应;间接ELISA结果表明,给药1周,未见动物产生抗体,从给药2周开始,所有动物均产生抗体,且随着给药时间的延长,抗体滴度明显上升。结论 rhIGF-1对动物具有致敏性、刺激性、免疫原性,但不引起溶血反应。

昆虫细胞表达重组人胰岛素样生长因子1的研究

目的 利用杆状病毒 Ac MNPV载体在昆虫细胞中表达重组人胰岛素样生长因子 1( rh IGF- 1)。方法 含有胰岛素样生长因子 1( IGF- 1) c DNA的重组 Ac MNPV感染昆虫细胞株 Sf9及 Sf2 1后 ,采用酶联免疫吸附试验 ( EL ISA)检测被重组病毒感染的昆虫细胞表达产生的 rh IGF- 1,以野生型 Ac MNPV感染的昆虫细胞及空白细胞的细胞培养液、细胞裂解物作对照。结果 1重组 Ac MNPV感染的昆虫细胞大量表达有免疫活性的 rh IGF- 1,并可分泌至细胞培养液中 ;2受感染昆虫细胞 Sf2 1的培养上清中 rh IGF- 1含量较 Sf9高 ,而细胞裂解物则相反。结论 利用杆状病毒表达系统在昆虫细胞 Sf9和 Sf2 1中可大量表达 rh IGF-

重组人胰岛素样生长因子1对db／db小鼠血糖的影响

目的:研究重组人胰岛素样生长因子1(rhIGF-1)对近似于人类2型糖尿病的db/db小鼠的降血糖作用。方法:正常饲养db/db及同品系的正常小鼠,定期监测血糖和血胰岛素水平。待db/db小鼠表现出明显的高血糖及高胰岛素血症后随机分为4组,每日皮下注射溶媒、胰岛素或不同剂量的rhIGF-1,共2周。首次给药后每30min测定血糖1次,观测不同干预方式的即时降糖效果。再于每次给药前测定血糖,观察2周内的变化趋势。结果:db/db小鼠饲养至8周龄时表现出明显的血糖升高及高胰岛素血症。所用剂量的胰岛素对db/db小鼠未表现出明显的降血糖作用;rhIGF-1特别是高剂量rhIGF-1的即时及短期降糖效果均较明显,可有效保护db/db小鼠。结论:rhIGF-1对db/db小鼠有较好的降血糖作用,对伴有明显胰岛素抵抗的糖尿病患者具有临床应用前景。

重组人胰岛素样生长因子1的促糖代谢作用研究

目的研究胰岛素样生长因子1（IGFI）对糖代谢的影响。方法分别以Balb／c3T3成纤维细胞和昆明种小鼠为对象，研究重组人胰岛素样生长因子1（rhIGF1）的降糖作用。结果①IGF1使Balb／c3T3细胞培养液的葡萄糖浓度降到对照组的65％，与胰岛素的降糖能力相似；②IGF1能使小鼠血糖降到正常值的20％左右，降糖作用呈剂量-效应曲线。结论IGF1对体内和体外两种模型都有明显的降糖作用。

重组人胰岛素样生长因子能促进鸭胚肌肉发育

四川农业大学丁庆峰等通过卵内注射技术分别向鸭胚蛋白中注射120、100、80和0（对照组）ng／mL的重组人胰岛素样生长因子（rhlGF-1），通过检测2日龄雏鸭胸肌发育和卵泡抑素（FST）表达的情况，探讨不同浓度rhIGF-1对FST表达及鸭胸肌发育的影响。