重组人血清白蛋白-干扰素α2b融合蛋白在PichiaPink系统中的表达

目的:比较PichiaPink表达系统和巴斯德毕赤酵母GS115在表达外源蛋白方面的差异,对PichiaPink表达系统的潜在优点进行评价。方法:以重组人血清白蛋白-干扰素α2b融合蛋白(HSA-IFN-α2b)为报告蛋白,构建相关载体,分别转化PichiaPink系统菌株和巴斯德毕赤酵母GS115菌株,诱导HSA-IFN-α2b表达并测定表达水平;通过SDS-PAGE检测HSA-IFN-α2b在PichiaPink系统中的降解程度。结果:PichiaPink系统几乎所有的转化子都可以表达HSA-IFN-α2b,而GS115菌株只有60%的转化子能表达HSA-IFN-α2b;同一种Pink菌株中,整合有高拷贝数表达载体pPink-HC的菌株表达量高于整合有低拷贝数表达载体pPink-LC的菌株;Pink蛋白酶缺陷菌株在复杂培养基(YPD,BMMY)中HSA-IFN-α2b基本没有降解,而在合成培养基(BSM)中降解现象明显。结论:PichiaPink表达系统产生的转化子较GS115菌株产生的转化子易于筛选;PichiaPink系统蛋白酶缺陷菌株可明显减少外源蛋白降解。这些结果为利用PichiaPink表达系统高水平和大规模制备外源蛋白提供了实验依据。

重组人血清白蛋白-干扰素α-2b 融合蛋白体外抗乙型肝炎病毒活性评价

目的检测重组人血清白蛋白-干扰素α-2b融合蛋白(HSA-IFNα-2b)体外抗乙型肝炎病毒(HBV)的活性。方法构建含1.6倍HBV基因组及绿色荧光蛋白的重组腺病毒(AdGFP-HBV),感染人肝细胞系HepG2细胞,构建HBV复制细胞模型;ELISA法检测HBV乙肝病毒表面抗原(HBsAg)和乙肝病毒e抗原(HBeAg)表达;MTT法检测HSA-IFNα-2b对HepG2细胞的毒性作用;定量PCR法检测细胞内HBV RNA的相对表达以及细胞上清中HBV DNA绝对表达水平;双报告基因法检测HSA-IFNα-2b对HBV增强子Ⅰ活性的影响。结果 AdGFP-HBV感染HepG2细胞后可以复制表达HBV。HSA-IFNα-2b 500 kU·L-1加入AdGFP-HBV感染的HepG2细胞,使HBsAg表达降低51.32%(P<0.01),HBeAg降低50.26%(P<0.01),而相同浓度的HSA-IFNα-2b并不抑制细胞的增殖。随HSA-IFNα-2b浓度增加,其对HBsAg表达的抑制作用逐渐升高,HSA-IFNα-2b对HBsAg表达的抑制率(Y)与其浓度(X)的回归方程是Y=21.11 lgX+11.91(r2=0.954),IC50为63.76 kU·L-1。HSA-IFNα-2b 500 kU·L-1使细胞中HBV RNA下降52.83%(P<0.01),培养上清中HBV DNA降低53.07%(P<0.01)。HSA-IFNα-2b 500 kU·L-1使HBV增强子Ⅰ活性下降40.04%(P<0.01)。结论构建了可用于药物评价的HBV复制细胞模型,HSA-IFNα-2b体外具有抗HBV活性。

^99Tc^m-半乳糖基化人血清白蛋白融合干扰素α2b的制备和生物分布

用氯化亚锡(SnCl2)还原法制备99Tcm-半乳糖基化人血清白蛋白融合干扰素α2b(GHSA-IFNα2b),研究了SnCl2和GHSA-IFNα2b的用量以及溶液pH对99Tcm-GHSA-IFNα2b标记率的影响;ICR小鼠尾静脉注射99Tcm-GHSA-IFNα2b(0.286MBq/只,n=6),于5、10、15、30、60、120min取脏器和血,称重、计数,计算%ID(organ)-1和%ID·g-1;并对99Tcm-GHSA-IFNα2b的SD大鼠显像进行了研究。结果表明,在pH=3.0~4.5、GHSA-IFNα2b的用量≥0.3mg、SnCl2的用量为3~60μg时,37℃反应30min,可得标记率>90%的99Tcm-GHSA-IFNα2b,并在6h内保持基本稳定;肝脏组织中的99Tcm-GHSA-IFNα2b在注射后10min高达52.51%ID(organ)-1,能够被肝脏特异性摄取,主要通过胆道、肠道排泄;大鼠静脉注射15~30min时,即可获得清晰的肝显像。

重组人血清白蛋白与干扰素α-2b融合蛋白中聚乙二醇1500残余量测定方法研究

目的:探讨重组人血清白蛋白与干扰素α-2b融合蛋白中聚乙二醇1500(PEG1500)残留量的检测方法。方法:选择3个不同批次重组人血清白蛋白与干扰素α-2b融合蛋白原液作为供试品,采用聚乙二醇残余量测定法,参照药品质量标准分析方法验证指导原则,分别设计专属性、线性范围、准确性、精密性、定量限实验进行测定。结果:该实验方法专属性、准确性、精密度及5.05~50.50μg/mL范围的线性关系良好,定量限为1.94μg/mL。结论:该实验方法用于人血清白蛋白与干扰素α-2b融合蛋白原液的PEG1500残余量检测,结果准确、可靠。

重组人白蛋白干扰素α-2b融合蛋白的稳定性研究

研究重组人白蛋白干扰素α-2b融合蛋白(rHSA-IFNα-2b)的稳定性。以抗病毒活性和纯度为主要检测指标,考察rHSA-IFNα-2b的热稳定性,酸碱稳定性以及冻融耐受性。rHSA-IFNα-2b在37℃、55℃下放置5h后生物学活性无明显降低,60℃水浴1h即可见活性降低了约40%;pH值(分别为2、3、9)改变时,生物学活性未发生明显变化;rHSA-IFNα-2b反复冻融后聚合体逐渐增加,冻融4次后聚合体含量达到17.91%,但生物学活性无明显降低。重组人白蛋白干扰素α-2b融合蛋白对热、酸碱变化稳定,但不宜冻融。

白蛋白融合α-2b干扰素在毕赤酵母中的表达

α2b干扰素的重组表达质粒pPIC9KHSAIFNα2b经限制性内切酶SalI酶切线性化后电转化巴斯德毕赤酵母菌(P.Pastoris)SMD1168,将阳性转化子进行PCR鉴定和Mut表型鉴定并用甲醇诱导表达,WesternBlot结果表明白蛋白融合IFNα蛋白与IFNα抗体具有结合能力,Wish细胞VSV病毒系统鉴定表达蛋白具有抗病毒生物活性。在摇瓶培养条件下,甲醇在0.5%～4.0%的范围,随着浓度的升高蛋白表达量也升高,在其他因素固定时,菌体起始OD值在5～80的范围内,随着OD值的升高表达量反而下降。成功表达出具有高生物学活性的白蛋白融合干扰素蛋白(HSAIFNα2b),为进一步应用打下基础。

人血清白蛋白和干扰素α2b融合蛋白在毕赤酵母中表达及质量控制

筛选获得毕赤酵母工程菌GS115/pPIC9K/hsa-ifnα2b,胞外分泌表达rHSA-IFNα2b药物蛋白。经摇瓶及5 L发酵罐条件优化,确定最佳发酵条件。经50 L发酵罐工艺放大,发酵产量稳定,可达到350 mg/L。离心获得发酵上清液,超滤浓缩10倍,再依次通过Blue Sepharose 6FF亲和层析、Phenyl Sepharose 6FF疏水层析及Q Sepharose 6FF离子柱纯化。纯化产品进行SDS-PAGE纯度检测、SEC-HPLC检测、相对分子质量测定、N端测序、内毒素检测和生物活性检测。筛选获得一株高产菌,优化获得最佳的发酵条件。纯化产品检测(SEC-HPLC)纯度大于95%,相对分子质量为85 821,氨基酸的N端测序为DAHKSEVAHRFKDLG,与预期的相符。内毒素含量小于5EU/mg,符合国家药典的要求。体外生物细胞活性高达1.6×106IU/mg。具有良好的工业应用价值。

猕猴体内白蛋白融合干扰素α-2b(HSA-IFNα-2b)的药代动力学研究

目的研究白蛋白融合干扰素α-2b(HSA-IFNα-2b)在猕猴体内的药代动力学。方法按照50μg.kg-1iv、50μg.kg-1sc和300μg.kg-1sc3种剂量组给猕猴注射HSA-IFNα-2b,分别在14个时间点采血,用ELISA方法测定血药浓度,计算药代动力学参数。结果3组受试猕猴均能在336h以前的各时间点测到HSA-IFNα-2b药物。一房室模型(weight=1/C2)分析药物浓度-时间曲线显示:50μg.kg-1iv、50μg.kg-1sc和300μg.kg-1sc3个剂量组的分布容积分别为67、71和63ml.kg-1。HSA-IFNα-2b皮下注射吸收相对缓慢,单剂量50μg.kg-1sc的吸收半衰期约为19h,消除半衰期为53h,清除率为0.92ml.h-1.kg-1,生物利用度达73%。结论HSA-IFNα-2b猕猴体内研究表明其药代动力学优于非融合干扰素,提示使用HSA-IFNα-2b可以减少用药次数,并有可能提高疗效。

白蛋白融合干扰素α-2b在猕猴体内的免疫原性研究

研究白蛋白融合干扰素α-2b(Woferon)对猕猴的免疫源性,从而为药物安全性评价提供数据支持。实验方法为猕猴皮下注射白蛋白融合干扰素α-2b,每周一次,连续5次,在不同时间点采取血样,用ELISA方法检测血样中抗白蛋白融合干扰素α-2b抗体的产生情况。结果(1)在给药剂量50、200和800μg/kg范围内,第15天有83%(15/18)的动物产生了抗Woferon抗体,66%(16/18)的动物产生了抗普通干扰素抗体,27%(5/18)的动物产生了抗人白蛋白抗体;第28天有94%(17/18)的动物产生了抗Woferon抗体和抗普通干扰素抗体,77%(14/18)的动物产生了抗人白蛋白抗体。(2)在试验剂量范围内,产生抗体的效价与给药剂量无显著相关性。(3)当抗体效价在1∶800以上时,产生的抗Woferon抗体可完全中和药物,使其失去抗病毒活性。

白蛋白融合干扰素α-2b猕猴长期毒性试验

用人血清白蛋白(HSA)对干扰素进行修饰,制成的新型白蛋白-干扰素融合蛋白(Albumin-Interferon fusion protein,A-IFN,Woferon),不仅保留了干扰素的生物学功能,而且使用时更加安全。为了确定Woferon的安全性,开展了猕猴皮下给药长期毒性试验,观察动物重复给药后的一般生活状态及心电图、血液学、血液生化和尿液等指标的变化。结果猕猴皮下注射高剂量(800μg/kg)白蛋白融合干扰素α-2b会引起可逆性白细胞(WBC)、血小板(PLT)下降和天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)的升高;猕猴对200μg/kg剂量有较好的耐受性;50μg/kg为无毒性反应剂量。TK研究表明:50μg/kg剂量,Cmax为(434.8±38.0)ng/ml,临床拟用剂量下血浆药物浓度为8ng/ml,安全倍数超过50倍。

重组人干扰素α-2b喷雾剂联合炎琥宁治疗小儿手足口病的临床疗效观察

目的分析重组人干扰素α-2b喷雾剂联合炎琥宁治疗小儿手足口病的临床疗效。方法回顾分析我院2018年2月至2020年2月期间收治的80例小儿手足口病患儿,按治疗方式分组,其中40例接受重组人干扰素α-2b喷雾剂联合炎琥宁治疗(观察组),另40例接受重组人干扰素α-2b治疗(对照组),比较治疗疗效、血清炎性因子、免疫蛋白水平等。结果观察组治疗疗效95%高于对照组67.50%(P<0.05);治疗前组间炎性指标无统计学差异(P>0.05),治疗后,观察组白细胞介素10、白细胞介素6、白细胞介素1β低于对照组(P<0.05);比较血浆免疫球蛋白指标,治疗前组间数据无统计学差异(P>0.05),治疗后,观察组免疫球蛋白A、免疫球蛋白G、免疫球蛋白M高于对照组(P<0.05)。结论临床可考虑将重组人干扰素α-2b喷雾剂联合炎琥宁联合用于小儿手足口病疾病治疗中,患者血清炎性因子、免疫蛋白水平指标可得到明显改善,疗效理想。

重组人血清白蛋白-干扰素α2a融合蛋白质控方法与质量标准的建立

目的:建立重组人血清白蛋白-干扰素α2a融合蛋白(rHSA-IFNα2a)的质控方法和质量标准。方法:分别使用抗HSA抗体和抗IFNα2a抗体、采用免疫印迹法对成品进行鉴别试验,采用WISH细胞病变抑制法测定成品和原液的生物学活性,原液以胰蛋白酶酶切后,用HPLC分析肽图,其余项目按2010年版中国药典(三部)的规定进行检测。结果:样品与抗HSA抗体和抗IFNα2a抗体均呈阳性反应,比活性>1.5×105 IU.mg-1,其肽图与参考品的一致,其余项目均符合2010年版中国药典(三部)的规定,根据检测结果建立了rHSA-IFNα2a的质量标准。结论:建立的质控方法和质量标准可以保证rHSA-IFNα2a的安全、有效和质量可控,可以用于rHSA-IFNα2a的常规检定。

注射用重组人血清白蛋白与干扰素α2b融合蛋白稳定性研究

目的考察制品注射用重组人血清白蛋白与干扰素α2b融合蛋白的稳定性。方法按照《中国药典》2015年三部的方法进行检测,影响因素试验[(42±2)℃高温试验、(4 500±500)Lx强光照射试验、90%高湿试验]、加速试验(37℃加速试验与25℃加速试验)及长期稳定性试验,方法均按照《生物制品稳定性研究技术指导原则》进行。结果影响因素试验、加速试验及长期试验结果显示,温度对于本制品的纯度有一定的影响,随着试验温度越高,制品纯度变化越快,保存时间越短;湿度对制品的水分也有影响,其他指标相对稳定;通过长期稳定性考察发现,制品的试验样品在2~8℃密闭储存条件下保存24个月是相对稳定的,且各项考察指标均符合质量检定标准。结论本制品注射用重组人血清蛋白与干扰素α2b融合蛋白在2~8℃密闭储存条件下保存24个月,各项考察指标保持稳定,且均符合质量检定标准。

重组人血清白蛋白突变体干扰素2b融合蛋白的纯化

在成功构建人血清白蛋白突变体干扰素α2b融合蛋白(rmHSA-IFN-α2b)毕赤酵母工程菌株PicZαA/rmHSA-IFN-α2b/X33的基础上,建立了发酵分泌表达rmHSA-IFN-α2b的纯化工艺。对工程菌进行9 L罐高密度发酵后,离心收集发酵液上清,rmHSA-IFN-α2b的表达量为421 mg/L。对发酵液上清,依次进行3步纯化。第一步采用SP sepharose FF除去大部分色素和部分杂蛋白。第二步采用Blue sepharose FF根据亲和作用原理除去部分杂质。第三步采用Q sepharose FF除去溶剂和其他杂质以及类毒素。最终得到高纯度、有活性的rmHSA-IFN-α2b。通过HPLC检测和SDS-PAGE检测,最终产品的纯度都大于95%;通过活性检测,rmHSA-IFN-α2b的比活为1.5×106IU/mg。纯化总收率为25.3%。连续重复纯化6批,结果稳定。该工艺简单稳定,容易放大,适合规模化生产。简单高效纯化工艺的建立,为rmHSA-IFN-α2b后续研究奠定了坚实的基础。

人血清白蛋白融合干扰素α2b体外抑制乙肝病毒的实验研究

目的:研究长效干扰素人血清白蛋白融合干扰素(HSA-IFNα2b)对HepG2.2.15细胞增殖、凋亡及其HBsAg与HBeAg表达的影响,探讨其体外抑制乙肝病毒的机制。方法:采用SRB法分析HSA-IFNα2b作用HepG2.2.15细胞3,6 d后对其增殖的影响,酶联免疫分析不同剂量HSA-IFNα2b作用不同时间后HepG2.2.15细胞HBsAg与HBeAg的表达水平,Hochest33342、PI双染法观察细胞的凋亡和死亡,Western Blot印迹检测Bcl-2、Bax的表达。结果:HepG2.2.15细胞的增殖在加HSA-IFNα2b作用3,6 d后都有所抑制,细胞培养上清中HBsAg表达明显下降,并与浓度相关,HSA-IFNα2b浓度为10 000 U.mL-1时,培养6 d后HBsAg的抑制率达87%以上。Hochest33342、PI双染结果显示当HSA-IFNα2b浓度在1 250U.mL-1时可见少量的凋亡细胞,凋亡细胞数随着药物浓度的增大而增多,并有少量死亡细胞出现。Western Blot印迹检测随药物浓度的增加Bcl-2的表达降低而Bax的表达增加。结论:HSA-IFNα2b体外可明显抑制HepG2.2.15细胞的增殖及HB-sAg的表达,并可引起HepG2.2.15细胞的凋亡和死亡。