基因工程菌Pichia pastoris高密度发酵表达重组人血清白蛋白

在摇瓶条件下对基因工程菌 Pichia pastoris的发酵条件进行了实验 ,并根据摇瓶发酵的优化结果进行了补料分批高密度发酵。在分批发酵时 ,接种量为 1 0 %且种子细胞光密度 ( OD60 0 )为2 0左右时 ,细胞生长的延迟期约为 2 .1 1 h,细胞生长光密度与培养时间的关系模型为 :y=0 .7841 e0 .2 319t(线性相关系数 r=0 .9936) ;在补料发酵时细胞浓度可达 1 1 5 g/L～ 1 60 g/L (干重 ) ,在 1 2 0 h重组人血清白蛋白表达量达 3.

重组人血清白蛋白在Pichia pastoris中分泌表达影响因素的研究

为获得高产稳产重组人血清白蛋白的Pichiapastoris细胞株用于高密度发酵 ,构建了多种分泌表达载体 ,在Pichiapastoris中作表达 ,研究表达载体构建等因素对表达量的影响。发现采用酿酒酵母α性成熟因子前导肽比人血清白蛋白天然前导肽作为分泌信号肽的表达量要高 10 %左右。而载体整合方式、整合拷贝数、5’非翻译区的改造和甲醇利用表型等对表达量无规律性影响。筛选到的高表达株经高密度发酵 ,细胞湿重达 46 0 g/L ,发酵液上清的人血清白蛋白含量为 1 0 g/L。

离子交换层析分离纯化重组人血清白蛋白

通过层析实验 ,比较了几种阴离子交换剂在不同温度、p H值、离子强度、进样流速、进样浓度下对人血清白蛋白的吸附与脱附性能 ,研究了它们对人血清白蛋白和卵清蛋白的分离能力 ,并考察了柱层析过程中吸附载体对重组人血清白蛋白和杂蛋白的分离选择性。实验结果表明 :牌号为DEAE Sepharose FF的载体不仅对重组人血清白蛋白具有良好的分离度 。

重组人血清白蛋白发酵过程生长期的代谢计算

结合元素平衡和代谢平衡 ,建立了重组人血清白蛋白发酵过程生长期的数学模型 ,并按单纯形多变量最优化方法估算了模型的未知参数。该模型能较好地描述重组人血清白蛋白发酵过程生长期中各宏观反应速率之间的关系 ,为重组人血清白蛋白宿主菌—Pichiapastoris的高密度培养提供了依据。

重组人血清白蛋白生产工艺研究进展

人血清白蛋白是一种重要的临床药物 ,人源血浆白蛋白可能会传染病原体将逐步被重组白蛋白所代替。对用巴斯德毕赤酵母生产重组人血清白蛋白的表达系统、发酵方法。

发酵液中重组人血清白蛋白的纯化

采用摇瓶培养重组毕赤氏酵母(Pichia pastoris)表达并分泌重组人血清白蛋白(recombinant human se- rum albumin rHSA)至胞外,发酵液经(NH4)2SO4沉淀、离子交换层析、疏水层析和凝胶过滤分离纯化rHSA,纯化样 品经SDS-PAGE检测为单一条带。

重组人血清白蛋白发酵过程表达期的定量研究

结合元素平衡和代谢平衡 ,建立了重组人血清白蛋白发酵过程表达期的数学模型 ,按单纯形多变量最优化方法估算了模型的未知参数 ,并探讨了导致表达期不同阶段产物形成速率存在差异的可能原因。该模型能较好地描述重组人血清白蛋白发酵过程表达期中各宏观反应速率之间的关系 ,为重组人血清白蛋白的高效表达提供了线索。

重组人血清白蛋白-干扰素α2b融合蛋白在PichiaPink系统中的表达

目的:比较PichiaPink表达系统和巴斯德毕赤酵母GS115在表达外源蛋白方面的差异,对PichiaPink表达系统的潜在优点进行评价。方法:以重组人血清白蛋白-干扰素α2b融合蛋白(HSA-IFN-α2b)为报告蛋白,构建相关载体,分别转化PichiaPink系统菌株和巴斯德毕赤酵母GS115菌株,诱导HSA-IFN-α2b表达并测定表达水平;通过SDS-PAGE检测HSA-IFN-α2b在PichiaPink系统中的降解程度。结果:PichiaPink系统几乎所有的转化子都可以表达HSA-IFN-α2b,而GS115菌株只有60%的转化子能表达HSA-IFN-α2b;同一种Pink菌株中,整合有高拷贝数表达载体pPink-HC的菌株表达量高于整合有低拷贝数表达载体pPink-LC的菌株;Pink蛋白酶缺陷菌株在复杂培养基(YPD,BMMY)中HSA-IFN-α2b基本没有降解,而在合成培养基(BSM)中降解现象明显。结论:PichiaPink表达系统产生的转化子较GS115菌株产生的转化子易于筛选;PichiaPink系统蛋白酶缺陷菌株可明显减少外源蛋白降解。这些结果为利用PichiaPink表达系统高水平和大规模制备外源蛋白提供了实验依据。

人血清白蛋白及其重组表达研究进展

人血清白蛋白在医疗方面有广泛的应用,其可作为血容量扩张剂和辅助治疗剂、培养基组分和保护剂、药物制剂、诊断试剂和医疗器械包被剂等。基因重组技术提供了一种规模制备人血清白蛋白的有效途径,并已建立了多种人血清白蛋白的重组表达系统。本文综述了重组人血清白蛋白在细菌、真菌、转基因植物和转基因动物等表达系统中的发展和应用概况。

重组人血清淀粉样蛋白分离纯化及稳定性研究

目的建立人血清淀粉样蛋白1单体(HSAA1)的制备方法,并考察其活性及稳定性。方法利用基因重组技术构建重组HSAA1大肠杆菌工程菌,变性条件下进行层析纯化,透析复性纯化后蛋白,采用酶联免疫吸附法检测复性后SAA1的生物活性,在不同温度及不同pH值的缓冲液中考察其储存稳定性。结果SAA1在大肠杆菌E.coli中可溶性表达,纯化后蛋白纯度超过95%,透析复性后蛋白二级结构主要为α螺旋结构;SAA1质量浓度在0.01~2.50µg/mL范围内与吸光度值呈线性关系;SAA1在中性及偏碱性条件下的稳定性高于酸性条件;在pH 8的缓冲液体系中添加25%甘油,室温存放90 d后,SAA1无明显降解。结论采用原核表达体系,结合变性纯化及透析复性可获得高纯度的重组SAA1,可作为免疫检测的标准品和校准品,也可作为抗原制备相应单克隆抗体及多克隆抗体。

重组人血清白蛋白抗体检测方法的建立及确证

目的:建立一种高灵敏度、高特异性、操作简单快捷、通量高的重组人血清白蛋白(rHSA)抗体检测方法。方法:采用桥连ELISA法,即将rHSA包被于96孔板,加入待测血样及阳性对照,用辣根过氧化物酶标记的rHSA检测,显色读取D450nm/D570nm值;用此方法确定临界值、方法灵敏度、精密度、血药浓度对检测方法的影响,再以免疫清除法进行确证。结果:通过桥连ELISA法确定临界值为0.0492,方法灵敏度为352 ng/mL,方法板间、板内精密度均小于20%,且血药中的rHSA浓度为20μg/mL时不影响抗体的检测;经免疫清除法可将假阳性样本排除,从而提高了方法的特异性。结论:建立的方法可以准确、快速地检测出rHSA的特异性抗体。

毕赤酵母发酵生产重组人血清白蛋白高密度培养条件的研究

研究了毕赤酵母基因工程菌高密度培养条件。在全合成培养基的基础上考察了诱导过程中添加(NH4) 2 SO4、微量元素PTM1、油酸、甲醇加量及 pH等因素对重组人血清白蛋白表达的影响 ,发现PTM1能显著提高白蛋白的表达 ,6mL/L时蛋白表达量最大。诱导期硫酸铵浓度维持在 3g/L左右蛋白表达量最大 ,高于 3g/L抑制蛋白表达。酸性环境不利于蛋白表达 ,诱导过程维持pH6 0～ 6 5最佳。甲醇最佳诱导浓度为 10mL/L。添加0 0 5 %的油酸可有效提高蛋白表达。可以此作为发酵罐上发酵培养流加成分的参考。

重组人血清白蛋白在毕赤酵母表达中的降解控制

在利用转基因毕赤酵母发酵表达重组人血清白蛋白时 ,遇到了较为严重的蛋白降解 ;为了抑制蛋白的降解 ,分别研究了温度、pH值和氮源的加入对降解的影响。结果表明 ,pH值和氮源的加入对白蛋白的降解控制有显著的正面影响 ,而温度的变化对降解的影响不大。当控制pH为 7 0 ,添加酵母提取物和蛋白胨体积分数分别为0 5 %和 1 %时 ,白蛋白的降解得到了有效的控制 ,可得到质量分数为 5

重组人血清白蛋白在结构生物学方面的研究进展

人血清白蛋白（human serum albumin，HSA）是由585个氨基酸组成的无糖基化单链多肽，相对分子质量为665000，等电点为4.7～4.9。HSA是人血浆中含量最丰富的蛋白质之一，占血浆蛋白总量的60％。HSA主要由肝细胞合成，分泌进入血液循环系统，在人体代谢物和药物的转运、分布、代谢中发挥重要作用。同时，HSA对维持人正常血浆胶体渗透压和血浆pH起着至关重要的作用［1-3］。

一种转基因猪血中重组人血清白蛋白分离纯化新方法

基因工程技术已经成为研究和生产重组人血清白蛋白(rHSA)替代人血清白蛋白(HSA)的重点技术,而白蛋白的纯化则是该技术的关键。本文主要介绍了从转基因猪血中纯化rHSA的一种新方法,即热乙醇沉淀与多级色谱分离相结合的rHSA纯化方法。热乙醇沉淀法可从猪血浆中获得rHSA粗提取液,此时rHSA的纯度可达69.5%,回收率达51.3%。进一步采用多级色谱分离法,即阴离子交换色谱和反相色谱法进一步纯化,得到rHSA的最终纯度约为100.0%,总回收率为41.1%。该方法为从转基因猪血浆中大规模纯化用于临床和生化研究的高纯度rHSA提供可能,同时也为rHSA替代HSA奠定了基础。

非诱导型基因重组工程菌发酵产人血清白蛋白各种参数的变化规律

以无甲醇诱导型基因重组人血清白蛋白的毕赤氏酵母(Pichia pastoris)NCY-1为实验菌株,在10 L机械搅拌通风发酵罐水平和3 L摇瓶水平的基础上研究了该菌株发酵过程中参数的变化规律及铵根离子(NH4+)对发酵液中重组人血清白蛋白(r HSA)的影响。研究结果表明:发酵液中的r HSA的含量随菌体浓度的增加而增加;30 h后菌体进入稳定期,此时流加10 g/L的葡糖糖有利于发酵液中r HSA的表达,流加后发酵液中的r HSA最高产量可达到185 mg/L;发酵液中存在活性较高的蛋白酶,在发酵后期分解r HSA,但发酵液中铵离子(NH4+)质量浓度为3.0 g/L时能较好的抑制r HSA的分解。

毕赤酵母表达硒代重组人血清白蛋白

将能够成功表达重组人血清白蛋白(rHSA)的巴斯德毕赤酵母培养至诱导期后,流加亚硒酸钠,同时设空白对照发酵液(不加入亚硒酸钠),通过对比相同菌株在两组培养基中表达的rHSA的含硒量,判断硒能否以硒代氨基酸的形式存在于重组蛋白质中。发酵液经热处理、超滤、离子交换和丙酮沉淀等步骤后,进行Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳、X射线能量色散谱(EDX)和原子吸收分析。结果表明,加硒发酵液样品中硒元素的质量分数比对照多23.2%,硒与蛋白质的质量比为0.0069,高于对照发酵液近35倍,初步证明无机硒可以被毕赤酵母同化,转化为硒代氨基酸,并形成硒代重组蛋白质。

重组人血清白蛋白在紫花苜蓿中的转基因表达

为获得高产重组人血清白蛋白的转基因紫花苜蓿"游客"(Medicago sativa L. cv.‘Eureka’)株系用于规模化生产rHSA,构建了rHSA植物表达载体。以紫花苜蓿子叶愈伤组织为受体,通过农杆菌介导法进行遗传转化,筛选出潮霉素抗性植株,提取抗性再生紫花苜蓿植株基因组DNA做PCR鉴定,结果表明重组人血清白蛋白基因片段已整合到紫花苜蓿基因组中;提取转基因植株总蛋白,Western blotting检测结果表明rHSA在转基因植株中成功表达。此结果表明转基因紫花苜蓿可稳定表达rHSA。

更优生物创新药——长效重组人血清白蛋白融合蛋白

更优生物药是指治疗用生物制品蛋白质药物,其可通过生物药经化学分子修饰、或蛋白质与小分子药物化合价偶联,形成新的物理结构或改善构象,或通过生物药物与蛋白质、生物药物之间的基因融合以达到延长生物药物在体内半衰期、

重组人血清白蛋白与干扰素α-2b融合蛋白中聚乙二醇1500残余量测定方法研究

目的:探讨重组人血清白蛋白与干扰素α-2b融合蛋白中聚乙二醇1500(PEG1500)残留量的检测方法。方法:选择3个不同批次重组人血清白蛋白与干扰素α-2b融合蛋白原液作为供试品,采用聚乙二醇残余量测定法,参照药品质量标准分析方法验证指导原则,分别设计专属性、线性范围、准确性、精密性、定量限实验进行测定。结果:该实验方法专属性、准确性、精密度及5.05~50.50μg/mL范围的线性关系良好,定量限为1.94μg/mL。结论:该实验方法用于人血清白蛋白与干扰素α-2b融合蛋白原液的PEG1500残余量检测,结果准确、可靠。