重组人血管内皮细胞生长因子121cDNA的基因克隆、表达和鉴定

应用RT PCR方法 ,扩增人VEGF12 1cDNA基因片段 ,与酵母表达载体pPIC9K重组 ,获得表达质粒p9KVEGF12 1.该质粒转化毕赤酵母菌GS115 ,用G4 18 YPD平板筛选高拷贝转化子 ,PCR鉴定VEGF12 1cDNA与酵母染色体整合状态 ,高拷贝转化子用甲醇诱导表达 .工程菌用 5L发酵罐发酵 ,表达产物r hVEGF12 1占培养液中总蛋白量 70 %以上 .纯化产物促进牛毛细血管内皮 (BCE)细胞增殖 。

重组人血管内皮生长因子和重组人骨形态发生蛋白-7对大鼠成骨细胞增殖能力的影响

目的研究重组人血管内皮生长因子(recombinant human vascular endothelial growth factor,rhVEGF)和重组人骨形态发生蛋白-7(recombinant human bone morphogenetic protein-7,rhBMP-7)对成骨细胞增殖能力的影响。方法取大鼠颅盖骨组织块,采用改良组织块混合酶消化法培养成骨细胞,分成4组,第1组、第2组、第3组分别加3.125 ng/mL不含血清的rhVEGF培养液、50.000 ng/mL不含血清的rhBMP-7培养液、3.125 ng/mL不含血清的rhVEGF和50.000 ng/mL不含血清的rhBMP-7培养液,第4组加不含血清的培养液作为对照组,采用细胞培养技术,应用光镜、四甲基偶氮唑盐(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)法,分析不同浓度的rhVEGF和rhBMP-7对成骨细胞增殖的影响。结果与对照组相比,3.125 ng/mL rhVEGF和50.000 ng/mL rhBMP-7单独或者联合作用,在1、3、5 d均有促进细胞增殖的作用,与对照组的差异均有统计学意义(P<0.05),各组间比较差异也有统计学意义(P<0.05)。其中,3.125ng/mL rhVEGF和50.000ng/mL rhBMP-7单独或者两者联合作用于第3天时,成骨细胞增殖最显著。结论一定剂量的rhVEGF和rhBMP-7可明显促进成骨细胞的增殖。

血管内皮生长因子和骨形态发生蛋白7在细胞分化中的协同作用

目的:研究rhVEGF和rhBMP-7对成骨细胞分化能力的影响。方法:取大鼠颅盖骨组织块,采用改良组织块混合酶消化法培养成骨细胞,将不同浓度的rhVEGF和rhBMP-7加入第四代成骨细胞的培养基继续进行细胞培养,用碱性磷酸酶试剂盒检测定细胞在第1、3、5天的磷酸酶的活性,分析不同浓度的rhVEGF和rhBMP-7对成骨细胞分化的影响。结果:rhVEGF和rhBMP-7能促进成骨细胞的分化,其中,3.125ng/ml rhVEGF和50.000ng/ml rhBMP-7单独或者两者联合作用并于第3天时,对成骨细胞碱性磷酸酶活性的影响最明显。结论:一定剂量的rhVEGF和rhBMP-7可明显促进成骨细胞的分化。

在毕赤酵母中表达的重组人血管内皮生长因子(rhVEGF_(121))为氨基端4个氨基酸缺失的异构体

为获得重组人血管内皮生长因子 ,采用重叠PCR扩增出含Kozak顺序、α因子前导肽和hVEGF12 1的融合基因 ,经DNA测序无误后 ,插入Pichiapastoris酵母载体 ,并体外构建 4拷贝表达单元质粒pAO81 5 4KαVEGF12 1。表达载体转化酵母宿主菌GS1 1 5 ,筛选出高效表达hVEGF的转化子。摇瓶培养并 1 %甲醇诱导 80h的VEGF分泌性表达量可达 30mg L。表达产物经S Sepharose离子交换层析纯化后测活表明表达产物二聚体具有良好生物活性。SDS PAGE分析、Western印迹表明表达产物具有适宜的分子量和抗原性。VEGF蛋白经氨基端氨基酸测序证实纯化后的不同糖化程度产物为同一蛋白质 ,但均为氨基端缺失了 4个氨基酸的全长为 1 1 7个氨基酸的VEGF。

重组人血管内皮生长因子抑制剂中异天门冬氨酸含量检测

目的：建立对重组人血管内皮生长因子抑制剂进行异天门冬氨酸（Isoasp）含量检测的方法。方法：利用ISOQUANT异天门冬氨酸检测试剂盒并结合HPLC的方法检测重组人血管内皮生长因子抑制剂原液和成品中的Isoasp含量,并对该方法进行加标回收率试验、精密度和准确性的验证。结果：40、25、6.25 pmol·L-1的3种浓度对照品的加标回收率均在80%~120%的范围内。对1批原液和1批成品的各3个样品分别进行测定,原液和成品中每摩尔蛋白的Isoasp含量平均值分别为（0.066±0.010）、（0.093±0.008）mol,RSD分别为15.2%和8.6%,原液和成品中各1个样品的25 pmol·L-1对照品的加标回收率分别为90.2%和108.1%。结论：经方法学验证,本文所建立的方法可作为该产品的Isoasp含量的常规检测方法,也为融合蛋白及单抗类制品的Isoasp含量检测提供借鉴。

骨髓基质干细胞联合rhBMP-2/rhVEGF治疗兔早期激素性股骨头缺血性坏死的实验研究

目的探讨BMSCs联合rhBMP-2/rhVEGF对早期激素性股骨头缺血性坏死的治疗作用。方法选取建立早期激素性股骨头坏死动物模型新西兰大白兔30只,随机分为5组,每组6只。A组:模型对照组;B组:单纯减压;C组:减压后植入BMSCs;D组:减压后植入BMSCs联合rhBMP-2;E组:减压后植入BMSCs联合rhBMP-2/rhVEGF。治疗后4、8周时各组取3只兔采用X线观察股骨头结构变化,病理组织学。结果 E组股骨头结构清晰,骨小梁结构完整,骨质破坏明显修复,空骨陷窝减少,大量新生的血管,其骨陷窝阳性数及与血管数目与各组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论 BM-SCs联合rhBMP-2/rhVEGF治疗早期激素性股骨头坏死,促进作用血管形成,显著改善坏死股骨头的血运,促进骨修复。

rhVEGF对大鼠成骨细胞增殖及功能的影响

目的:研究rhVEGF对成骨细胞增殖和分化能力的影响。方法:采用细胞培养技术,应用光镜、MTT法及PNPP偶氮法,分别从细胞形态、细胞增殖及分化等特性,分析不同浓度的rhVEGF对成骨细胞增殖和碱性磷酸酶活性的影响。结果:rhVEGF能促进成骨细胞的增殖和分化,其中,在加入3.125ng/ml浓度的rhVEGF并于第3天时,成骨细胞增殖最显著;而12.5ng/ml组对碱性磷酸酶活性的影响最明显。结论:一定剂量的rhVEGF可明显促进成骨细胞的增殖和分化。

血清外泌体中miR-335-5p作为诊断三阴性乳腺癌的生物标志物研究

目的探讨三阴性乳腺癌(triple-negative breast cancer,TNBC)患者血清外泌体中微小RNA(microRNA-335-5p,miR-335-5p)和重组人血管内皮生长因子受体1(human vascular endothelial growth factor receptor 1,VEGFR-1,FLT1)表达水平及其诊断价值。方法高通量基因表达数据库(Gene Expression Omnibus database,GEO)分析并筛选乳腺癌组织中差异表达的miRNA,于2016年1月至2017年11月收集宁波大学附属人民医院的56例TNBC患者的外周血标本,分离外泌体并鉴定。生物信息学分析筛选出FLT1作为miR-335-5p的靶基因。qRT-PCR分别检测miR-335-5p、FLT1在血清外泌体中的表达水平。分析miR-335-5p与TNBC患者临床病理参数的关系,受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic,ROC)评估miR-335-5p的诊断价值,Kaplan-Meier生存曲线对miR-335-5p和FLT1做生存预后分析。结果TNBC患者血清外泌体中miR-335-5p表达低于对照组,FLT1在血清外泌体中的表达高于对照组(均P<0.05)。miR-335-5p表达情况与TNBC患者组织分级(χ^(2)=22.02,P<0.0001)、分化程度(χ^(2)=20.67,P<0.0001)、淋巴结转移有关(χ^(2)=4.667,P=0.0308);miR-335-5p诊断ROC下面积为0.8098(95%CI:0.7263~0.8932,P<0.0001)。Kaplan-Meier生存分析显示,miR-335-5p低表达组患者的总生存期较高表达组明显缩短(P=0.0045)。其靶基因FLT1的高表达与低生存率相关(P=0.0480)。结论血清外泌体源性miR-335-5p可作为预测TNBF预后的重要指标,有望在TNBC的诊断和治疗中发挥作用。